Διερεύνηση της αιτιολογίας της νέας ιώσεως γωνιώδες μωσαϊκό της αμπέλου

Abstract

In 1994, characteristic virus-like symptoms on grapevine were reported in the collection of the Grapevine Institute in Athens, Greece, on the hybrid Baresana x Baresana. The symptoms were sharp angular mosaic, leaf crinkle, and little leaf. The affected vines showed gradual decline and severe stunting or death. Such vines produced abortive flowers or very few berries with smaller, wrinkled, and nongerminating seeds. Serological testing, by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), of the affected vines against the most common grapevine viruses Alfalfa mosaic, Arabis mosaic, Grapevine fanleaf Grapevine fleck, Grapevine A, Raspberry ringspot, Carnation latent, Tomato ringspot and Grapevine leaf roll associated viruses gave negative results. A virus was isolated from affected grapevine young leaves by mechanical inoculation of Gomphrena globosa, and single lesioned. The virus host range includes Gomphrena globosa (local and systemic dark red or necrotic lesions), Chenopodium quinoa (necrotic local lesions and systemic mottle), and three tobacco cultivars (sharp necrotic local lesions, 1-3 mm in diameter). Pollination of C. quinoa with pollen from infected plant gave about 30% infected seedlings. The virus was purified from C. quinoa by differential centrifugation using 0,02 M phosphate buffer, pH 8, containing 0,01 M DIECA and 0,01 M sodium thioglycolate as extraction buffer. In purified preparation, quasispherical virus perticles of about 29nm were observed. Electrophoretic mobility of the viral coat protein showed a molecular weight of 30 kDa. Using purified preparations, an antiserum was obtained with a titer of 1:1024, in microprecipitin test, and an optimum IgG dilution in ELISA of 1:10.000 for maximum absorption at OD405nm. Using degenerate primers designed from homologous regions in RNA-2 corresponding to a fragment of the polymerase gene of Ilarviruses, the expected 381-bp polymerase reaction product was obtained. This product was cloned and sequenced. Comparisons with sequence data from the homologous regions of RNA-2 of other known Ilarviruses, showed that the sequence of the above 381-bp amplicon shared 72% sequence similarity with Tobacco streak virus, 67% with Citrus variegation virus and Spinach latent virus, 66% with Asparagus virus 2 and Elm mottle virus, and 65% with Citrus leaf rugose virus. Based on the above data, it is concluded that the isolated virus is an Ilarvirus with closest similarity to Tobacco streak virus. From the relative bibliography (Lehoczky et al., 1987, 1989, 1992, and Appendix 6 of this Thesis), it appears that the virus reported here is different from grapevine line pattern virus, a possible Ilarvirus, previously reported from Hungary. Using pollen of infected C. quinoa as inoculum, a healthy grapevine seedling from tissue culture was mechanically inoculated, and it showed the original symptomatology of Baresana x Baresana. Tissue from this grapevine plant was indexed by DAS-ELISA and found positive for GAMV. So, we conclude that the new Ilarvirus we isolated and studied is the cause of grapevine angular mosaic originally observed in the collection of Grapevine Institute of Athens in 1994 and we name it Grapevine angular mosaic ilarvirus (GAMV).

Το 1994 ανακοινώθηκε μία νέα ιολογική συμπτωματολογία της αμπέλου στην αμπελογραφική συλλογή του Ινστιτούτου Αμπέλου Αθηνών, επί του υβριδίου αμπέλου Baresana x Baresana. Η συμπτωματολογία αυτή ήταν χαρακτηριστικό σαφές γωνιώδες μωσαϊκό συνδεδεμένο με τα νεύρα και τις γωνίες των νεύρων των φύλλων, παραμόρφωση των φύλλων προκύπτουσα από αυτό, μικροφιλλία και μείωση του μεγέθους του πρέμνου. Οι ανθοταξίες των προσβεβλημένων πρέμνων πυρώνονταν ή παρήγαν ελάχιστους καρπούς και αυτούς με μικρότερα, ζαρωμένα και μη βλαστάνοντα γίγαρτα. Από προσβεβλημένα νεαρά φύλλα αμπέλου, απομονώθηκε, με μηχανική μετάδοση σε Gomphrena globosa, ένας ιός, ο οποίος προκαλεί στο είδος αυτό σκούρες ερυθροϊωδεις ή νεκρωτικές τοπικές και διασυστηματικές κηλίδες. Με την μέθοδο της απλής κηλίδας, αποκτήθηκε καθαρή καλλιέργεια του ιού, ο οποίος μεταδόθηκε μηχανικά και σε Chenopodium quinoa, καθώς και σε τέσσερα είδη Nicotiana: Ν. tabacum cv Samsun και cv Xanthi nc., Ν. glutinosa και Ν. benthamiana προκαλώντας σε όλα τοπικές νεκρωτικές κηλίδες διαμέτρου 1-3 mm και διασυστηματική μόλυνση με ή χωρίς συμπτώματα (νευρώσεις σε σχήμα "φύλλου δρυός"). Τα συμπτώματα στα είδη / ποικιλίες Nicotiana μειώνονταν ή καλύπτονταν σε υψηλές θερμοκρασίες (>30 C°). Επικονίαση C. quinoa με γύρη από μολυσμένο φυτό έδωσε περίπου 30% μολυσμένα σπορόφυτα. Οι ιδιότητες του ιού σε μολυσμένο χυμό in vitro ήσαν: όριο αραιώσεως (DEP) >10⁷, θερμοκρασία αδρανοποιήσεως (TIP) >75 C° και μακροβιότητα (LV) 20 ημέρες σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 22-25 C°. Ο ιός αυτός καθαρίστηκε από C quinoa με διαφορική φυγοκέντρηση, χρησιμοποιώντας για την εξαγωγή του 0,02 Μ φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα pH 8,0, με 0,01M DIECA και 0,01 Μ θειογλυκολικό νάτριο σε τελικό pH 5,3. Στο καθαρό παρασκεύασμα παρατηρήθηκαν, στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, σφαιροειδή ιικά σωματίδια 29 nm. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα της καψιδιακής πρωτεΐνης έδειξε Μ.Β. 30.000 daltons. Χρησιμοποιώντας καθαρά παρασκευάσματα ιικών σωματιδίων (περίπου 5mg/ml) παρήχθη σε κουνέλι αντιορρός με τίτλο 1:1024 σε δοκιμή μικροκατακρημνίσεως και με όριο αραιώσεως IgG 100.000 σε δοκιμή PTA ELISA (τίτλος με PTA ELISA) χρησιμοποιώντας σύζευγμα αντικουνελικού αντιορρού σε γίδα με αλκαλική φωσφατάση- (goat antirabbit-AP) (αραίωση 1:5.000). Η άριστη αραίωση των IgG στην PTA ELISA ήταν 10.000-20.000 για την μέγιστη απορρόφηση στα 405 nm. Η μορφολογία των σωματιδίων του ιού, η μεταδοτικότητα του με γύρη και με σπόρο και η μέθοδος καθαρισμού του μας οδήγησαν στην υπόθεση ότι πρόκειται περί ιού του γένους Ilarvirus. Η υπόθεση αυτή ελέγχθηκε με PCR, χρησιμοποιώντας εκφυλισμένους εκκινητές για την περιοχή της πολυμεράσης του RNA 2 των Ilarviruses. Αποκτήθηκε προϊόν PCR 381 ζευγών βάσεων το οποίο κλωνοποιήθηκε και αλληλουχήθηκε, οπότε η νουκλεοτιδική ακολουθία του έδειξε ομολογότητα με την αντίστοιχη γονιδιακή περιοχή έξι Ilarviruses ως εξής: Tobacco streak ilarvirus 72%, Citrus variegation ilarvirus και Spinach latent ilarvirus 67%, Asparagus virus 2 ilarvirus, Elm mottle ilarvirus 66% και Citrus leaf rugose ilarvirus 16 65%. Η μεγαλύτερη γενετική συγγένεια βρέθηκε με τον Tobacco streak ilarvirus (72%), τυπικό είδος του γένους Ilarvirus. Τα δεδομένα αυτά αποδεικνύουν ότι ο ιός που απομονώθηκε από το αμπέλι με γωνιώδες μωσαϊκό είναι Ilarvirus. Σύμφωνα με την βιβλιογραφική μας έρευνα και τις επικοινωνίες μας με σχετικούς ερευνητές διεθνώς και στην Ελλάδα, ο ιός αυτός είναι νέος, επειδή δε, με την πλήρωση όλων των κανόνων του Coch, αποδείξαμε ότι προκαλεί την μελετώμενη συμπτωματολογία της αμπέλου, τον θεωρούμε ως το αίτιο της μελετώμενης συμπτωματολογίας και ονομάζουμε Ιό του γωνιώδους μωσαϊκού της αμπέλου (Grapevine angular mosaic virus, GAMV). Επίσης, σύμφωνα με τις διαθέσιμες πληροφορίες διεθνώς, η παρούσα αναφορά εμφανίζεται η πρώτη για ανεύρεση ilarvirus στο αμπέλι. Προηγούμενη ερωτηματική αναφορά Ilarvirus στο αμπέλι αφορούσε στην ίωση "Γραμμικά σχέδια της αμπέλου" (Grapevine line pattern, GLP) που σημειώθηκε στην Ουγγαρία, η οποία όμως έχει εντελώς διαφορετική συμπτωματολογία και διαφορετικές ιδιότητες του ιού. Η έρευνα επί του τελευταίου ιού, με το προκαταρκτικό όνομα ιός τον γραμμικών σχεδίων της αμπέλου" (Grapevine line pattern virus, GLPV) δεν είναι ολοκληρωμένη, αναγνωρίζεται όμως και από τους ερευνητές του GLPV ότι οι GAMV και GLPV είναι δύο διαφορετικοί ιοί του γένους Ilarvirus. Έτσι, θεωρούμε ότι η παρούσα είναι η πρώτη αναφορά αποδεδειγμένης παρουσίας Ilarvirus σε Vitis. Τέλος, με τον GAMV έγινε δυνατή η αναπαραγωγή των χαρακτηριστικών συμπτωμάτων της ασθένειας του γωνιώδους μωσαϊκού της αμπέλου. Έτσι, συμπεραίνουμε ότι ο GAMV είναι τα αίτιο της ασθένειας αυτής. Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή έδειξε την ύπαρξη ενός νέου Ilarvirus, μίας νέας ιώσεως στο αμπέλι που προκαλείται από αυτόν και ένα Ilarvirus στο αμπέλι.