Χαρακτηρισμός και μελέτη του υποκινητή του ενζύμου πολυ(α) πολυμεράση και συσχέτιση των αλλαγών στα επίπεδα έκφρασης του ίδιου ενζύμου με τον καρκινικό φαινότυπο

Abstract

Polyadenylation is an integral part in the process of eukaryotic mRNA maturation. The key enzymes catalyzing this process are poly(A) polymerases. The poly(A) tail formed at the 3΄ end of eukaryotic messenger RNAs contributes to the transport from the nucleus to the cytoplasm, the stability and the translatability of mRNAs. Thus, poly(A) polymerases play a crucial role in the control of gene expression. Among poly(A) polymerases, poly(A) polymerase-a, coded by the PAPOLA gene, has been most extensively investigated. Increased poly(A) polymerase activity in cancer has been proposed as a marker of prognostic value in leukemias and breast cancer. The biochemistry and post-translational modifications that regulate its activity under physiological conditions have been described in detail. In cancer samples, increased activity levels reflect corresponding protein levels. To elucidate the underlying causes of PAPOLA overexpression, the mechanisms of transcriptional control of the PAPOLA gene were investigated by the characterization of its promoter. By using the 5’-RACE technique the transcription start site was mapped at 211 bases 5’ to the ATG translation start site. The 5´regulatory sequences of human PAPOLA gene are not conserved among species, they are GC rich and lack TATA and CAAT consensus sequences. These are characteristics shared by eukaryotic promoters of housekeeping genes. In order to identify the minimal promoter region, serially truncated segments of the 5’-flanking region of the gene were PCR produced and then cloned into a luciferase reporter vector. Transcription is induced by other Transcription Initiator Elements such as the Initiator sequence. Transient transfection analyses of the constructs in HΕΚ293 cells identified the basal promoter region within –98 to +100 base pairs relative to the transcription start site. Putative transcription factors’ binding regions, based on sequence analysis were determined. Transfection analyses indicated the presence of two negative regulatory elements at the –1231 to – 883 and at -164 to -98 upstream region of the transcription start site. Binding assays of these regions and subsequent identification of bound proteins by mass spectrometry revealed, among other non specifically binding proteins, CoAA and m4 that act as inhibitory transcription factors. Thus, the promoter of the PAPOLA gene has characteristics of housekeeping gene with additional negative regulation. Further negative control in PAPOLA expression was found to be imposed by the 5’UTR of the gene The PAPOLA 211 bp long 5’ UTR was found to be GC rich (71%). Eukaryotic leader sequences are on average 50 - 70 bases in length whereas longer leaders are invariably involved in regulation. Moreover, there are two initiation codons in the 5’ UTR of the PAPOLA mRNA, embedded in a highly structured leader sequence preceding the main ORF. Both AUGs are followed by ORFs. Comparison of the human PAPOLA leader sequence to the corresponding DNA sequences from other mammals revealed a complete homology of the uORF1 and partial of the uORF2. Mutation of the 5’ proximal AUG resulted in increased translational efficiency of the adjacent coding sequence, whereas no significant effect was observed after mutation of the second AUG. These observations imply that translational regulation is among the conserved mechanisms regulating PAPOLA expression. It is generally assumed that the role of an uORF is to secure low levels of expression of the protein, when abundant levels are harmful to the cell. It is possible that under altered physiological conditions or in diseased state the function of the uORFs may be modified. The presence of the two uORFs clearly suggests that PAPOLA is subject to negative regulation of its translation, superimposed upon negative regulation of its transcription. Negative transcriptional and translational control is a common occurrence in proto-oncogenes, growth factor and growth factor receptor genes as well as other genes involved in cell growth and differentiation. Controlling PAPOLA levels has been shown to be critical, as overexpression of this enzyme interferes with normal cell growth. The overexpression of PAPOLA, which has been observed in cancer, may be tolerated by the malignant cell. It may even contribute to a more aggressive disease phenotype by facilitating the expression of the short lived messages that code for cytokines, growth factors and oncogenes, through their polyadenylation. Further studies are needed in order to elucidate how this stringent regulation of PAPOLA is lost in cancer and also the consequences of its overexpression.

Η πολυαδενυλίωση αποτελεί αναπόσπαστο μέρος της διαδικασίας ωρίμανσης του ευκαρυωτικού mRNA. Τα ένζυμα που επιτελούν πολυαδενυλίωση αποκαλούνται πολυ(Α) πολυμεράσες. Η πολυαδενυλική ουρά δρα ενισχυτικά στη σταθεροποίηση του μηνύματος RNA, στη μεταφορά του στο κυτταρόπλασμα και στην αποτελεσματική έναρξη της μετάφρασης. Άρα, οι πολυ(Α) πολυμεράσες διαδραματίζουν καίριο ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Μεταξύ των πολυ(Α) πολυμερασών η πολυ(Α) πολυμεράση-α, που κωδικοποιείται από το γονίδιο PAPOLA, είναι η πλέον μελετημένη. Η μέτρηση των επιπέδων ενεργότητας της πολυ(Α)πολυμεράσης στον καρκίνο έχει προταθεί ως δείκτης προγνωστικής αξίας σε χρόνιες λευχαιμίες και στον καρκίνο του μαστού. Η βιοχημεία και οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που ρυθμίζουν την ενεργότητά της στις φυσιολογικές συνθήκες έχουν μελετηθεί λεπτομερώς. Σε δείγματα καρκίνου μαστού τα αυξημένα επίπεδα ενεργότητας συνδέονται με αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης. Με στόχο να διευκρινιστούν οι αιτίες που οδηγούν σε υπερέκφραση της PAPOLA μελετήθηκαν οι μηχανισμοί μεταγραφικού ελέγχου του γονιδίου της και ειδικότερα χαρακτηρίστηκε ο υποκινητής του γονιδίου. Το σημείο έναρξης της μεταγραφής (ΣΕΜ) προσδιορίστηκε (με την τεχνική 5’-RACE) 211 νουκλεοτίδια πριν από το σημείο έναρξης της μετάφρασης ATG. Οι 5’ ρυθμιστικές αλληλουχίες του γονιδίου της PAPOLA δεν περιείχαν τις τυπικές αλληλουχίες TATA και CAAT που χαρακτηρίζουν τους περισσότερους υποκινητές ευκαρυωτικών γονιδίων, ήταν πλούσιες σε GC και δεν ήταν συντηρημένες. Συγκέντρωναν δηλαδή τα χαρακτηριστικά υποκινητών «συστατικά εκφραζόμενων» γονιδίων (housekeeping genes). Επίσης προσδιορίστηκαν αλληλουχίες πιθανής πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων, όπως ο SP1. Για τον εντοπισμό του ελάχιστου υποκινητή, κλωνοποιήθηκαν διαδοχικά μειούμενου μεγέθους αλληλουχίες από την 5’ περιοχή του γονιδίου. σε πλασμίδιο αναφοράς που έφερε το γονίδιο της λουσιφεράσης. Ο ελάχιστος υποκινητής προσδιορίστηκε στην περιοχή –98 με +100 νουκλεοτιδίων εκατέρωθεν του ΣΕΜ με πειράματα παροδικής διαμόλυνσης κυττάρων HEK 293. Σε αυτή τη περιοχή εντοπίστηκε η αλληλουχία εκκινητή (initiator). Οι περιοχές από –1231 έως –883 νουκλεοτιδίων και από -164 έως -98 νουκλεοτιδίων σε σχέση με το ΣΕΜ είχαν κατασταλτική δράση στην μεταγραφική δραστηριότητα του ελάχιστου υποκινητή. Ανάλυση με φασματομετρία μάζας των πρωτεϊνών που προσδένονται στις περιοχές αυτές, κατέδειξε εκτός από μη-ειδικά προσδενόμενες πρωτεΐνες και την παρουσία των CoAA και m4, που έχει αναφερθεί ότι δρουν ως αναστολείς της μεταγραφικής δραστηριότητας. Από τα ανωτέρω συμπεραίνεται ότι ο υποκινητής της PAPOLA έχει χαρακτηριστικά υποκινητών «συστατικά εκφραζόμενων» γονιδίων και υπόκειται σε αρνητικό ρυθμιστικό έλεγχο. Αρνητικός ρυθμιστικός έλεγχος της έκφρασης του γονιδίου της PAPOLA καταδείχτηκε ότι επιτυγχάνεται και μέσω της εκτεταμένης 5’ μη μεταφραζόμενης περιοχής. Η περιοχή αυτή, μήκους 211 νουκλεοτιδίων, είναι πλούσια σε GC (71%). Στην πλειονότητα των ευκαρυωτικών γονιδίων η περιοχή αυτή έχει μήκος 50-70 νουκλεοτιδίων και όταν είναι μεγαλύτερη συνήθως παίζει ρυθμιστικό ρόλο. Η 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή της PAPOLA, εκτός από τη σταθερή διαμόρφωση δευτεροταγούς δομής που παρουσιάζει, διαθέτει δυο ανοδικά ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (uORFs). Φυλογενετική σύγκριση με αντίστοιχες αλληλουχίες άλλων θηλαστικών αποκάλυψε πλήρη ταύτιση όλων των uORF1 και μερική ομολογία μεταξύ των uORF2. Πειράματα μεταλλαξογένεσης στο κωδικόνιο έναρξης που βρίσκεται πλησιέστερα στο 5’ άκρο του μηνύματος έδειξαν αυξημένη ενεργότητα λουσιφεράσης. Αντίστοιχα πειράματα στο δεύτερο κωδικόνιο έναρξης δεν έδωσαν το ίδιο αποτέλεσμα. Οι παραπάνω παρατηρήσεις αποδεικνύουν ότι ο μηχανισμός ρύθμισης της μετάφρασης του γονιδίου της PAPOLA είναι συντηρημένος. Γενικά θεωρείται ότι η παρουσία ενός uORF περιορίζει τα επίπεδα έκφρασης της σύστοιχης πρωτεΐνης και συναντάται σε γονίδια που η αυξημένη έκφρασή τους βλάπτει το κύτταρο. Είναι πιθανό ότι σε αλλαγές των φυσιολογικών συνθηκών ή σε παθολογικές καταστάσεις οι λειτουργίες αυτών των uORFs τροποποιούνται. Η παρουσία των δυο uORFs σαφώς υποδεικνύει ότι η PAPOLA υπόκειται σε αρνητική ρύθμιση της μετάφρασής της, παράλληλα με την αρνητική ρύθμιση της μεταγραφής της. Η διπλή αρνητική ρύθμιση, σε μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο, απαντάται σε πρωτο-ογκογονίδια, γονίδια παραγόντων ανάπτυξης και γονίδια υποδοχέων παραγόντων ανάπτυξης, όπως και σε άλλα γονίδια που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και στη διαφοροποίηση. Η ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης της PAPOLA είναι ζωτική για το κύτταρο γιατί η υπερέκφραση του ενζύμου αναστέλλει τον κυτταρικό κύκλο. Φαίνεται ότι σε καρκινικά κύτταρα η υπερέκφραση του ενζύμου δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα του κυττάρου όπως συμβαίνει σε φυσιολογικά κύτταρα. Ίσως μάλιστα να συνεισφέρει στη διαμόρφωση του επιθετικού φαινότυπου της νόσου, επιτείνοντας μέσω της πολυαδενυλίωσής τους, την έκφραση άλλων μηνυμάτων που φυσιολογικά έχουν μικρό χρόνο ημιζωής και κωδικοποιούν κυτοκίνες, παράγοντες ανάπτυξης και ογκογονίδια. Η παρούσα εργασία υπαγορεύει περαιτέρω μελέτες ώστε να διερευνηθεί τόσο ο μηχανισμός απορρύθμισης αυτού του αυστηρού ελέγχου έκφρασης της PAPOLA στον καρκίνο, οι επιπτώσεις της υπερέκφρασής της.