Σύνθεση και αναλυτικές εφαρμογές προϊόντων σύζευξης της φωτοπρωτεΐνης ακουορίνης με ολιγονουκλεοτίδια: ανάλυση γενετικά τροποποιημένων τροφίμων

Abstract

This doctoral thesis is focused on the preparation of biomolecular conjugates that combine the molecular recognition properties of oligonucleotides with the high detectability of the photoprotein aequorin as reporter molecule. Central to the conjugation protocols is the use of recombinant aequorin fused to a hexahistidine tag. In one protocol, an amino-modified oligonucleotide was treated with a homobifunctional cross-linker carrying two N-hydroxy succinimide ester groups and the derivative was allowed to react with (His)6-aequorin. A second strategy involved the introduction of protected sulphydryl groups into (His)6-aequorin and subsequent reaction with a heterobifunctional linker containing a N-hydroxy succinimide and a maleimide group. The strong, but reversible, binding of (His)6-aequorin to Ni2+-nitrilotriacetic acid agarose enabled the rapid and effective removal of the unreacted oligonucleotide, which otherwise deteriorates the performance of the hybridization assay by competing with the conjugate for the complementary target sequence. Aequorin-oligo conjugates prepared by affinity capture showed similar performance with those purified by anion exchange HPLC. The conjugates were applied to the development of rapid bioluminetric hybridization assays. The analytical range extended from 2 to 2000 pmol/L of target DNA. The reproducibility of the hybridization assay was less than 10%. The conjugate obtained from a reaction of 10 nmoles of (His)6-aequorin is sufficient for about 5000 hybridization assays. The proposed conjugation strategy is general because a variety of reporter proteins can be fused to hexahistidine tag by using suitable vectors that are commercially available. A universal detection reagent was produced through conjugation of aequorin to the oligonucleotide (dA)30 and used as a reporter in highly sensitive and automatable hybridization assays for the analysis of transgenic sequences in genetically modified organisms (GMO). The terminator of the nopaline synthase gene (NOS) from the Agrobacterium tumefaciens and the 35S promoter were detected in genetically modified soybean. The endogenous, soybean-specific, lectin gene was also detected for confirmation of the integrity of extracted DNA. Biotinylated (through PCR) products for the three target sequences were captured onto streptavidin coated wells and one strand was removed by NaOH treatment. The immobilized single stranded DNAs were then hybridized with oligonucleotide probes consisting of a target-specific segment and a poly(dT) tail. This allowed the subsequent determination of all hybrids by using the (dA)30-aequorin conjugate as a universal reagent. The bound aequorin was measured by adding Ca2+ and integrating the light emission for 3 s. As low as 2 pM (100 amol per well) of amplified DNA was detectable for all three targets with a signal-to-background ratio of about 2. The analytical range extended up to 2000 pM. As low as 0.05% content in soybean can be detected with a signal-to-background ratio of 8.2. The overall reproducibility of the proposed assay, including DNA extraction, PCR, and hybridization assay, ranged from 7.5 to 19.8%. The use of (dA)30-aequorin conjugate renders the assay configuration general for any target DNA provided that the specific probe carries a poly(dT) tail.

Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής παρασκευάστηκαν ενώσεις σύζευξης βιομορίων που συνδυάζουν την ιδιότητα συμπληρωματικότητας των ολιγονουκλεοτιδίων με την εξαιρετική ευαισθησία της φωτοπρωτεΐνης ακουορίνης ως ιχνηθέτη. Σημαντικό σημείο στις μεθόδους σύζευξης που αναπτύχθηκαν είναι η χρήση ανασυνδυασμένης ακουορίνης που φέρει ομάδα έξι ιστιδινών στο αμινο-τελικό άκρο της. Η παρασκευή των προϊόντων σύζευξης πραγματοποιήθηκε τόσο με τη χρήση ομοδιλειτουργικών όσο και με τη χρήση ετεροδιλειτουργικών αντιδραστηρίων. Σύμφωνα με την πρώτη μέθοδο, αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο αντιδρά με ομοδιλειτουργικό αντιδραστήριο που έχει δύο λειτουργικές ομάδες εστέρων του Ν-υδροξυ ηλεκτριμιδίου και στη συνέχεια το ενεργοποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο αντιδρά με την (His)6-ακουορίνη. Σύμφωνα με τη δεύτερη μέθοδο, προστατευμένες σουλφυδρυλομάδες εισάγονται στην (His)6-ακουορίνη και στη συνέχεια, η ενεργοποιημένη (His)6-ακουορίνη αντιδρά με ετεροδιλειτουργικό αντιδραστήριο που περιέχει μία ομάδα εστέρα του Ν-υδροξυ-ηλεκτριμιδίου (η οποία αντιδρά με το αμινο-τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο) και μία ομάδα μηλεϊναμιδίου. Η ισχυρή αλλά αντιστρεπτή δέσμευση της (His)6-ακουορίνης στη Ni2+-ΝΤΑ αγαρόζη χρησιμοποιήθηκε για την ταχεία και αποτελεσματική απομάκρυνση της περίσσειας του ελεύθερου ολιγονουκλεοτιδίου από το προϊόν της αντίδρασης σύζευξης. Η πλήρης απομάκρυνση του ελεύθερου ολιγονουκλεοτιδίου είναι απαραίτητη λόγω συναγωνιστικής δράσης του με το προϊόν σύζευξης για τη συμπληρωματική αλληλουχία στη δοκιμασία υβριδισμού. Οι ενώσεις σύζευξης ακουορίνης-ολιγονουκλεοτιδίου που απομονώθηκαν σε ένα στάδιο με χρωματογραφία συγγένειας ακινητοποιημένου μετάλλου ήταν εξίσου λειτουργικές με τις ενώσεις οι οποίες υποβλήθηκαν σε ένα επιπλέον στάδιο καθαρισμού με HPLC σε ανιονανταλλακτική στήλη. Οι ενώσεις σύζευξης χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη σύντομων δοκιμασιών υβριδισμού με βιοφωταυγή ανίχνευση. Η περιοχή γραμμικότητας μεταξύ εκπεμπόμενης ακτινοβολίας και συγκέντρωσης του αναλύτη είναι ευρεία και εκτείνεται από 2 έως 2.000 pM (τρεις τάξεις συγκέντρωσης). Η ακρίβεια της δοκιμασίας υβριδισμού (%CV) κυμαίνεται μεταξύ 2 και 9%. Η ποσότητα του αντιδραστηρίου σύζευξης που παρασκευάζεται από 10 nmol (His)6-ακουορίνης επαρκεί για περίπου 5.000 δοκιμασίες υβριδισμού. Ο μέθοδοι σύνθεσης και απομόνωσης προϊόντων σύζευξης ακουορίνης με ολιγονουκλεοτίδια που αναπτύχθηκαν στην παρούσα διατριβή μπορούν να εφαρμοστούν και σε άλλες πρωτεΐνες που φέρουν ιστιδίνες και κωδικοποιούνται από κατάλληλα εμπορικά διαθέσιμα πλασμίδια. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε για τη σύνθεση και απομόνωση προϊόντων σύζευξης εφαρμόστηκε για τη σύζευξη της (His)6-ακουορίνης με ολιγονουκλεοτίδιο (dA)30 και την παρασκευή αντιδραστηρίου ανίχνευσης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε οποιαδήποτε δοκιμασία υβριδισμού ανεξαρτήτως της αλληλουχίας του αναλύτη. Το προϊόν σύζευξης (His)6-ακουορίνης-(dA)30 χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη ευαίσθητης δοκιμασίας υβριδισμού για τον προσδιορισμό γενετικά τροποποιημένων οργανισμών (GMO). Ανιχνεύθηκαν οι αλληλουχίες του τερματισμού της συνθετάσης της νοπαλίνης (nopaline synthase terminator) και του προαγωγέα της 35S υπομονάδας του ιού μωσαϊκού του κουνουπιδιού σε γενετικά τροποποιημένη σόγια. Επίσης, ανιχνεύθηκε το ενδογενές γονίδιο της λεκτίνης, που είναι ειδικό για τη σόγια, για τον έλεγχο της ποιότητας του απομονωμένου DNA. Σύμφωνα με την αναπτυχθείσα δοκιμασία υβριδισμού, βιοτινιλιωμένα (μέσω PCR) προϊόντα πολλαπλασιασμού κάθε αλληλουχίας ακινητοποιούνται σε πλακίδια μικροτιτλοδότησης επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη. Στη συνέχεια, ο μη βιοτινιλιωμένος κλώνος απομακρύνεται με κατεργασία με NaOH. Ο ακινητοποιημένος κλώνος υβριδοποιείται με ολιγονουκλεοτίδιο που αποτελείται από ένα τμήμα συμπληρωματικό προς αλληλουχία του αναλύτη και ουρά δεοξυνουκλεοτιδίων θυμίνης (dT) στο 3’ άκρο του. Ο προσδιορισμός και των τριών προϊόντων γίνεται με προσθήκη του αντιδραστηρίου (dA)30-ακουορίνης και μέτρηση της ακτινοβολίας της δεσμευμένης ακουορίνης μετά την προσθήκη Ca2+. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου που αναπτύχθηκε είναι 2 pM (100 amol/φρεάτιο) και για τις τρεις αλληλουχίες, με λόγο σήματος προς σήμα υποβάθρου περίπου 2. Η περιοχή γραμμικότητας εκτείνεται έως 2.000 pM. Με εφαρμογή της μεθόδου σε πρότυπα δείγματα γενετικά τροποποιημένης σόγιας ανιχνεύθηκαν GMOs περιεκτικότητας 0,05% με λόγο σήματος προς σήμα υποβάθρου 8,2. Η ακρίβεια της μεθόδου συμπεριλαμβανομένων της απομόνωσης του DNA, της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης και της δοκιμασίας υβριδισμού κυμαίνεται από 7,5 έως 19,8%. Επίσης, η μέθοδος που αναπτύχθηκε παρέχει δυνατότητα αυτοματοποίησης. Η χρήση του προϊόντος σύζευξης (dA)30-ακουορίνης καθιστά τη δοκιμασία υβριδισμού γενική για οποιαδήποτε αλληλουχία DNA αρκεί το ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτής να φέρει ουρά δεοξυνουκλεοτιδίων θυμίνης (dT).