In vitro και in situ αξιολόγηση των μηχανισμών δράσης ενός παράγοντα ενασβεστίωσης (CCP-ACP) στους σκληρούς οδοντικούς ιστούς

Abstract

Milk and diary products have demonstrated an anticariogenic potential in human and animal models, mainly assigned to the effect of a milk-phosphoprotein (casein) in combination with the calcium-phosphate components of these products. It has been shown that casein phosphopeptides (CPP) have the capacity to stabilize calcium phosphates in solution through binding amorphous calcium phosphate (ACP) to their multiple phosphoserine residues, forming small CPP–ACP clusters. The anticariogenic effects of CPP–ACP on hard dental tissues may be attributed to suppression of demineralization, enhancement of remineralization, or combination of both. The aim of this study was to investigate in vitro and in situ the interaction mechanism of a commercially available remineralizing agent based on a casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate (CCPACP) system. MATERIALS AND METHODS The agent tested was Tooth Mousse (GC International). The in vitro studies performed were: Α) Micro MIR-FTIR study of the extent of demineralization and remineralization on dentin specimens. Forty dentin specimens were prepared by horizontally sectioning the crowns of sound extracted third molars with hard tissue microtome. The specimens were divided in four groups (A-D, n=10 each). All the specimen surfaces were subjected to surface analysis by Fourier transform micro-multiple internal reflectance infrared spectroscopy (micro MIR-FTIR). The agent was applied on dentin surface specimens of group A, whereas no agent was applied on the specimens of group B (control). All the specimens (groups A-D) were immersed in a demineralizing agent according to tenCate and Duijsters (1982). After 7 days immersion the surfaces of specimens were subjected to micro MIR-FTIR and the mineral (P=O str of hydroxyapatite ~1000 cm- 1) to the organic matrix (C=O str of R1-NCO-R2 or amide I ~1655 cm-1) ratio was used to assess the percentage extent of dentin demineralization of each sample relative to its intact control. The agent was applied on dentin specimens of group C, while the specimens of group D received no treatment (control). Finally, the specimens of groups C and D were immersed in artificial saliva for 7 days according to Smith et al. (2005), subjected again to micro MIR-FTIR and the mineral to matrix ratios were calculated again to assess the extent of dentin remineralization of each sample. Statistical analysis was performed by Student t-test (a=0.05) 154 Β) Micro XCT evaluation of the remineralization capacity of natural carious lesions, without cavity formation. Twenty carious premolars and molars with 2, 3 or 4, caries ranking according to ICDAS II criteria were used in this study. The teeth were imaged by high resolution micro-XCT and divided randomly in two groups (A and B, n=10). Tooth Mousse was applied on the carious surfaces of group A, while the carious surfaces of group B received no treatment. All the teeth were immersed in artificial saliva for 7 days and imaged again by micro-XCT. The tomographic sections were recorded and reconstructed using the 2D-software of the instrument, and the percentage extent of the reduction of the carious lesions before and after treatment were calculated with an image analysis program. Statistical analysis was performed by paired t-test before and after treatment and t-test between the two groups after the treatment (a=0.05) C) LV-SEM evaluation of demineralized dentin surface topography after application of the agent. Three dentin specimens were prepared by horizontally sectioning the crowns of intact extracted molars extracted with a hard tissue microtome. The top surface was demineralized with 37% orthophosphoric acid for 10 s. Immediately after, the surfaces were examined by LV-SEM. Then the agent was applied on acid demineralized dentin, the specimens were immersed in artificial saliva for 7 days and imaged again by LVSEM. D) Buffering capacity of the agent The buffer capacity was performed by a) pH measurements after gradual lactic acid addition (pH=4.5) and b) pH measurements after gradual agent dilution with distilled water. E) In situ mesurements Five subjects aged 20-35 with good oral health participated in the in situ experiment. Removable orthodontic appliances were made with a custom made retainer for Ge crystals, enamel and dentin slab specimens. ........................................

Σήμερα ο τρόπος αντιμετώπισης της τερηδόνας βασίζεται σε ένα σύνολο ενεργειών που αναφέρονται: στην πρόληψη και καταστολή της εξέλιξης της τερηδονογόνου νόσου, στην αναχαίτιση των αρχόμενων τερηδονικών βλαβών και τέλος στην αποκατάσταση των οδοντικών ιστών, όπου είναι αναγκαίο, με την ελάχιστη επέμβαση στους ιστούς. Συνεπώς, η ανάπτυξη βιοενεργών παραγόντων οι οποίοι με την απελευθέρωση στοιχείων τους στο στοματικό περιβάλλον μπορούν να λειτουργήσουν τόσο για την αναχαίτιση της τερηδονικής βλάβης όσο και για την επούλωση των προσβεβλημένων οδοντικών ιστών, παρουσιάζει ιδιαίτερο κλινικό και ερευνητικό ενδιαφέρον. Στην κατηγορία αυτών των υλικών κλινικά κυριαρχούν για πολλά χρόνια οι διάφοροι τύποι φθοριούχων σκευασμάτων, δίνοντας άλλοτε άλλου βαθμού ικανοποιητικά αποτελέσματα. Πρόσφατα, όμως κυκλοφόρησε στο εμπόριο ένας τέτοιος παράγοντας, ο οποίος βασίζεται στο σύμπλοκο μέρους μιας πρωτεΐνης του γάλακτος, η οποία ονομάζεται φωσφοπεπτίδιο της καζεΐνης (CPP) και του άμορφου φωσφορικού ασβεστίου. Σκοπός της ερευνητικής μελέτης είναι να μελετηθεί in vitro και in situ οι μηχανισμοί δράσης ενός σύγχρονου εμπορικού παράγοντα ενασβεστίωσης των σκληρών οδοντικών ιστών, ο οποίος βασίζεται στο σύμπλοκο φωσφοπεπτιδίου καζεΐνης-άμορφου φωσφορικού ασβεστίου (CCP-ACP). Για το σκοπό της μελέτης χρησιμοποιήθηκε το εμπορικό σκεύασμα Tooth Mousse (GC International). Ο μηχανισμός δράσης του ενασβεστιωτικού παράγοντα διερευνήθηκε με εργαστηριακές μελέτες και μελέτες in situ. Πραγματοποιήθηκαν οι ακόλουθες εργαστηριακές μελέτες: Α) Μελέτη της επίδρασης του παράγοντα σε τεχνητή απασβεστίωση και επανασβεστίωση οδοντίνης με μικροϋπέρυθρη φασματοσκοπία πολλαπλής εσωτερικής ανάκλασης μετασχηματισμού Fourier (micro MIR-FTIR). Με τη βοήθεια μικροτόμου σκληρών οδοντικών ιστών παρασκευάστηκαν 40 παραλληλεπίπεδα δοκίμια οδοντίνης. Τα δοκίμια αυτά χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες τις Α, Β, Γ και Δ (ν=10). Στα δοκίμια των ομάδων Α και Β λήφθηκαν φάσματα με την τεχνική micro MIR-FTIR. Στα δοκίμια της ομάδας Α έγινε επάλειψη της επιφάνειας τους με τον υπό μελέτη παράγοντα. Στα δοκίμια της Β ομάδας δεν έγινε καμία επάλειψη (ομάδα ελέγχου). Ακολούθως, τα δοκίμια και των δύο ομάδων (Α και Β) καθώς και των Γ και Δ τοποθετήθηκαν σε απασβεστιωστικό ρυθμιστικό διάλυμα, το οποίο έχει περιγραφεί από τους tenCate και Duijsters (1982). Αμέσως μετά το πέρας των 7 ημερών έγινε λήψη φάσματος των επιφανειών και των τεσσάρων ομάδων δοκιμίων. Ακολούθως, στις επιφάνειες των δοκιμίων της ομάδας Γ έγινε επάλειψη του παράγοντα ενώ σε εκείνες της ομάδας Δ δεν έγινε καμία επεξεργασία. Στη συνέχεια τα δοκίμια και των δύο ομάδων τοποθετήθηκαν σε τεχνητό σάλιο για 7 ημέρες, η σύσταση του οποίου έχει περιγραφεί από τους Smith και συν. (2005). Σε κάθε φάσμα που λήφθηκε από όλες τις ομάδες υπολογίστηκε 151 ποσοτικά η αναλογία οργανικών / ανόργανων υπόστρωμα της οδοντίνης και μετρήθηκε η απασβεστίωση και επανασβεστίωση. Β) Μελέτη της επίδρασης του παράγοντα στην επανασβεστίωση δοντιών με τερηδόνα χωρίς σχηματισμό κοιλότητας, με μικροϋπολογιστική τομογραφία ακτίνων-Χ (micro CTX). Χρησιμοποιήθηκαν 20 τερηδονισμένοι προγόμφιοι και γομφίοι με βαθμός τερηδονισμού 2, 3 ή 4, σύμφωνα με τα κλινικά κριτήρια ICDAS II. Τα δόντια απεικονίστηκαν με τη χρήση μικροϋπολογιστικού τομογράφου ακτίνων-Χ. Τα δόντια χωρίστηκαν σε δύο ομάδες Α και Β (ν=10). Στα δόντια της ομάδας Α έγινε επάλειψη της επιφάνειας που εμφάνιζε τερηδονική αλλοίωση με τον παράγοντα ενώ στα δόντια της ομάδας Β δεν έγινε καμία επεξεργασία. Στη συνέχεια τα δόντια και των δύο ομάδων τοποθετήθηκαν στο τεχνητό σάλιο για 7 ημέρες, και επαναλήφθηκε η απεικόνιση τους στον μικροτομογράφο. ................................