Θερμοεπαγώμενα γονίδια της οικογένειας HSP70 σε νηματώδεις του εδάφους

Abstract

Nematodes are an important animal group comprising both parasitic species that threaten the health of plants, animals, and humans on a global scale, and free-living species that pervade sediment and soil ecosystems in overwhelming numbers. Nematode community structure can be used as a bioindicator in environmental monitoring. Classification and systematics of Nematodes has been hampered by the lack of reliable morphological and clearly homologous characters (Blaxter et al. 1998), since they can show a wide range of intraspecific variation when reared under different environmental conditions. The evolutionarily conserved genetic system of the HSP70 gene family was studied in several nematode species and populations, attempting to detect genetic characters in order to distinguish nematode species. Synthetic oligonucleotide primers were designed and constructed based on Caenorhabditis elegans hsp70 related sequences. Polymerase chain reactions (PCR) resulted in amplified DNA fragments, which exhibited distinct and reproducible band patterns that characterize different nematode species and populations. The different profiles that all nematode species presented could reflect the divergence of the hsp70 related sequences. This hypothesis is supported by several results, such as: (a) C. elegans amplification products correspond to the expected sizes of DNA fragments containing hsp70 sequences, (b) most of the amplified fragments in all other nematodes studied are hybridized with known hsp70 gene sequences, and (c) DNA sequencing data showed that many of the amplified fragments contained hsp70 related sequences. Thus, it is plausible to assume that the different organization of the hsp70 sequences in nematodes can be used as a molecular marker. The different molecular size of some amplified fragments might designate the sequence variability of the introns that the fragments contain, along with the intron genomic position. The sequence analysis of a substrate-binding domain segment for the hsp-1 gene (cytoplasmic homologue) in Acrobeloides nanus showed that like the orthologue gene of C. elegans it contains no intron, differently from other nematode species. No intron was also found in a sequence of the ATPase domain of the hsp-6 gene (mitochondrial homologue) in Neodiplogasteridae sp., in contrast to C. elegans. Both PCR and genomic hybridization data provided efficient differentiation among A. nanus isolates from Greece. This genomic divergence might reflect possible duplications concerning hsp70-related loci. A fragment of 140 noucleotides, corresponding to the 25% of the substrate binding domain in all hsp70 sequences was further used for phylogenetic analyses among nematodes and between nematodes and other taxa. The main conclusions of the phylogenetic analyses conducted in the present study can be summarized as follows: (a) hsp70 sequences are divided and grouped according to their cellular localization and thus, their specific function, (b) all sequences are grouped according to the codon usage that they present, (c) they show the possible existence of at least three major lineages concerning the evolution of the hsp70 sequences in nematodes, (d) they exhibit the progressive evolution of nematode parasites from free-living ancestor species, (e) they declare two major groups of hsp70 sequences in nematodes, implying possible phylogenetic relationships among the members of each group, and (f) they provide evidence for phylogenetic relationships among both closely and distantly related taxa, and thus could be used as a molecular marker.

Οι νηματώδεις είναι ένα από τα πιο σημαντικά φύλα μεταζώων, το οποίο αποτελείται από παρασιτικά είδη, που απειλούν την υγεία του ανθρώπου, των ζώων και των φυτών σε παγκόσμια κλίμακα. Επίσης, αποτελείται από είδη ελεύθερης μορφής, τα οποία διασπείρονται σε εδαφικά και υδάτινα οικοσυστήματα με εξαιρετικά μεγάλα πληθυσμιακά μεγέθη. Οι βιοκοινότητες των νηματωδών θα μπορούσαν να αποτελέσουν έναν πολύ ικανοποιητικό βιολογικό δείκτη περιβαλλοντικών αλλαγών. Η ταξινόμηση και η συστηματική κατάταξη των ειδών του φύλου είναι μία δύσκολη και επίπονη διαδικασία, εξαιτίας της έλλειψης σταθερών ομόλογων χαρακτήρων. Οι μορφολογικοί χαρακτήρες που χρησιμοποιούνται για τη διάκριση των ειδών ποικίλουν εξαιρετικά ανάλογα με το περιβάλλον του είδους, στο οποίο αναφέρονται. Το εξελικτικά συντηρημένο γονιδιακό σύστημα της οικογένειας HSP70 μελετήθηκε σε είδη και πληθυσμούς νηματωδών του εδάφους, με σκοπό την εύρεση γενοτυπικών χαρακτήρων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση των ειδών. Συνθετικοί ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές σχεδιάστηκαν και κατασκευάστηκαν με βάση αλληλουχίες hsp70 του είδους Caenorhabditis elegans. Η χρησιμοποίηση των εκκινητών για την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) είχε ως αποτέλεσμα την ενίσχυση διακριτών ζωνών σε όλα τα είδη και τους πληθυσμούς των νηματωδών, που μελετήθηκαν. Η διαφοροποίηση, που παρατηρείται με βάση τα ζωνικά πρότυπα των προϊόντων της PCR, δίνει τη δυνατότητα ταυτοποίησης διαφορετικών ειδών και πληθυσμών νηματωδών, η οποία πιθανά αντιπροσωπεύει διαφοροποιήσεις των αλληλουχιών hsp70. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από το ότι: (α) στο είδος C. elegans όλες οι ζώνες που ενισχύθηκαν μπορούν να αντιστοιχιστούν με τμήματα αλληλουχιών hsp70, (β) πολλές από τις ζώνες που παράγονται στα υπόλοιπα είδη νηματωδών υβριδίζονται με ανιχνευτές γνωστές αλληλουχίες hsp70 και (γ) η ανάλυση της πρωτοδιάταξης των βάσεων του DNA έδειξε ότι αρκετές από τις ζώνες αυτές περιείχαν αλληλουχίες σχετικές με hsp70. Φαίνεται λοιπόν ότι, η διαφορετική οργάνωση και οι διαφοροποιήσεις των αλληλουχιών hsp70 αποτελούν έναν εύχρηστο μοριακό χαρακτήρα και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μοριακός μάρτυρας. Η παρατηρούμενη διαφοροποίηση του μεγέθους των ζωνών, που ενισχύονται σε όλα τα είδη νηματωδών, πιθανά οφείλεται στην ύπαρξη ή την απουσία των εσωνικών αλληλουχιών, ή και το διαφορετικό μήκος τους. Τμήμα της περιοχής δέσμευσης του πεπτιδίου του γονιδίου hsp-1 (κυτταροπλασματικό ομόλογο της οικογένειας HSP70) στο είδος Acrobeloides nanus δε βρέθηκε να περιέχει εσώνιο, σε αντίθεση με άλλα είδη νηματωδών. Επίσης, δε βρέθηκε να περιέχεται εσώνιο σε τμήμα της περιοχής δέσμευσης του ΑΤΡ του γονιδίου hsp-6 (μιτοχονδριακό ομόλογο) στο είδος Neodiplogasteridae sp. σε αντίθεση με το είδος C. elegans. Δεδομένα, που προέκυψαν από την PCR και τους γονιδιωματικούς υβριδισμούς κατά Southern, έδειξαν διαφοροποίηση μεταξύ των Ελληνικών πληθυσμών του είδους A. nanus. Η διαφοροποίηση αυτή μπορεί να οφείλεται σε διπλασιασμό κάποιου γονιδιακού τόπου σχετικού με αλληλουχίες hsp70, αφού πληθυσμοί του παραπάνω είδους βρέθηκε ότι περιέχουν αρκετές επιπλέον ζώνες DNA. Αλληλουχίες hsp70 μήκους 140 νουκλεοτιδίων χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των φυλογενετικών σχέσεων των νηματωδών και άλλων ειδών. Τα σημαντικότερα συμπεράσματα που προέκυψαν από τις αναλύσεις αυτές, συνοψίζονται παρακάτω. Το τμήμα δέσμευσης του πεπτιδίου που μελετήθηκε (α) διαχωρίζει τις αλληλουχίες hsp70 ανάλογα με το κυτταρικό διαμέρισμα στο οποίο δρουν παρέχοντας με αυτόν τον τρόπο λειτουργική διάκριση μεταξύ τους, (β) ομαδοποιεί τις αλληλουχίες με βάση τη χρησιμοποίηση των κωδικονίων, (γ) καταδεικνύει την ύπαρξη τουλάχιστον τριών διαφορετικών εξελικτικών σειρών κατά την πορεία των αλληλουχιών hsp70 στους νηματώδεις, (δ) δείχνει την πορεία που πιθανά ακολούθησαν οι νηματώδεις κατά τη σταδιακή τους μετάβαση από είδη 'ελεύθερης μορφής’ σε παράσιτα, (ε) διακρίνει δύο μεγάλες ομάδες αλληλουχιών hsp70 παρέχοντας στοιχεία για την πιθανή φυλογενετική πορεία των ειδών- φορέων τους και (στ) διευκρινίζει τις πιθανές φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ εξελικτικά συγγενικών αλλά και μεταξύ απομακρυσμένων ταξινομικών ομάδων, αποτελώντας έναν ικανοποιητικό μοριακό μάρτυρα.