Μοριακή και οροεπιδημιολογική μελέτη του μικροοργανισμού chlamydia pneumoniae σε αναπνευστικούς και αθηρωματικούς ασθενείς

Abstract

Chlamydia pneumoniae is a Gram-negative intracellular bacterium responsible for acute upper and lower respiratory tract infections. However interest has been focused on its possible association with chronic diseases such as atherosclerosis. A seroepidemiological study was conducted in order to determine the prevalence of IgG and IgA antibodies to Chlamydia pneumoniae in North Greece. Serology was also used to confirm acute in respiratory and past or persistent infection in atherosclerotic patients. Molocular techniques were used to detect C. pneumoniae DNA and nucleotide sequence analysis was performed to study the strains. 530 serum specimens were collected from apparently healthy people from all the age groups for the seroepidemiology. 82 and 116 sera from respiratory and atherosclerotic patients were also collected for serological diagnosis as well as 90 respiratory specimens and 122 atherosclerotic plaques for the detection of Chlamydia pneumoniae DNA. IgM, IgG and IgA antibodies to C. pneumoniae were measured by an enzyme linked immuno abosorbent assay. C. pneumoniae DNA in respiratory and atherosclerotic specimens was determined by nested polymerase chain reaction (PCR) and a further nucleotide sequence analysis was performed. The prevalence of IgG and IgA antibodies to C. pneumoniae in North Greece was 53,39% and 46,6% respectively. The age distribution showed a gradual increase of IgG and IgA antibodies from 16,17% and 17,6% to 78,7% and 67% respectively. These results indicate that infection with C. pneumoniae occurs early in life and the rate of infection continues to the elderly. The prevalence of IgG antibodies at the age group of 7m-10y is 16,17% and reaches to 40% by the age of 20 years. IgA antibodies to C. pneumoniae increase accordingly, although in lower levels. The seroprevalence reaches 78,7% for IgG and 67% for IgA antibodies among elderly. IgM antibodies in respiratory patients were detected at a level of 12,2%, including acute infection, although these results were not confirmed by detection of the microorganism in the same patients by molecular techniques. In atherosclerotic cases, a statistically significant difference was found in IgA levels among patients and controls (79,3% and 67% respectively, p=0,024), while there was not any statistical difference in IgG levels. That means that IgA antibodies are a marker of persistent, chronic infection, whereas IgG are only a marker of past infection. C. pneumoniae DNA was not detected in respiratory specimens but it was present in 15 of 122 atheromatic plaques (12,29%). Noucleotide sequence analysis of the ompA gene showed that our strains had 100% homology with J138 strain of C. pneumoniae and lower homology with other strains of chlamydophila genus. Nucleotide sequence analysis of ygeD-urk, 23bp, region showed that the strains detected belong to two different genotypes CpnThessaloniki I and CpnThessaloniki II, with only one strain having the reverse orientation of that 23bp region. So the prevalent type in North Greece is CpnThessaloniki I. In conclusion, it seems from our results that C. pneumoniae is present in the community and a proportion of 53,39% of the population has IgG antibodies against it. It contributes to the respiratory infections at a rate of 12,2%. It was detected in atherosclerotic plaques in 12,29% of the cases and it means that it could be a possible etiological co-factor in the pathogenesis of the disease. This is supported from the statistically significant difference in IgA prevalence in patients versus controls. The strains detected had 100% homology with the reference strain of the microorganism and they were divided into 2 different genotypes I and II with type I being the prevalent one. As this survey is the only one completely covering C. pneumoniae in Greece it will be used as reference to future studies.

Το Χλαμύδιο της πνευμονίας είναι υποχρεωτικά ενδοκυττάριος μικροοργανισμός που προκαλεί λοιμώξεις του ανώτερου αλλά και κατώτερου αναπνευστικού, έχει όμως ενοχοποιηθεί και για χρόνιες εξελικτικές νόσους όπως η αθηροσκλήρωση. Στην παρούσα μελέτη έγινε οροεπιδημιολογικός έλεγχος της διακίνησης του Χλαμυδίου της πνευμονίας στη Β. Ελλάδα. Έγινε επίσης ορολογικός έλεγχος των αναπνευστικών ασθενών και των ασθενών με αθηρωμάτωση για την επιβεβαίωση οξείας ή χρόνιας ενεργού λοίμωξης από τον μικροοργανισμό, μοριακή ανίχνευση του DNA του Χλαμυδίου της πνευμονίας στους παραπάνω ασθενείς καθώς και μοριακή μελέτη των ανιχνευθέντων στελεχών. Το υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 530 οροί αίματος, ατόμων όλων των ηλικιών, 90 αναπνευστικά δείγματα και 122 αθηρωματικές πλάκες ισάριθμων ασθενών από τους οποίους έγινε λήψη επιπλέον 82 και 116 ορών αίματος αντίστοιχα. Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ο ανοσοπροσροφητικός προσδιορισμός για την ανεύρεση των αντισωμάτων έναντι του Χλαμυδίου της πνευμονίας, η Nested Touchdown PCR για την ανίχνευση του γενετικού υλικού του μικροοργανισμού και η Nested PCR για την περαιτέρω μελέτη των ανιχνευθέντων μικροοργανισμών. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το λογισμικό πρόγραμμα SPSS version 11,5 με εγκατεστημένο το υποσύστημα exact test. Από τα αποτελέσματά μας φαίνεται ότι το Χλαμύδιο της πνευμονίας διακινείται στη Β. Ελλάδα σε αναλογίες οροθετικότητας 53,39 % για τα IgG αντισώματα και 46,6% για τα IgA. Η ηλικιακή κατανομή των αποτελεσμάτων μας, δείχνει μια προοδευτική αύξηση των επιπέδων των IgG και IgA αντισωμάτων από 16,17% και 17, 6% έως και 78,7% και 67% αντίστοιχα, γεγονός που αποδεικνύει τη μόλυνση από την πρώτη παιδική ηλικία αλλά και τη συνεχή επαφή του πληθυσμού με τον μικροοργανισμό αυτό. Μέχρι την ηλικία των 20 ετών, σημειώνεται απότομη αύξηση των IgG αντισωμάτων και φαίνεται ότι το 40% του πληθυσμού έχει έρθει σε επαφή με το μικροοργανισμό. Παράλληλα αυξάνουν και οι αναλογίες των IgA αντισωμάτων αλλά σε χαμηλότερες αναλογίες 26,67%. Η αύξηση συνεχίζεται και στις επόμενες ηλικίες σταδιακά, για να φθάσει στο 78,7% και 67% στις ηλικίες άνω των 51 ετών, αντίστοιχα. Ο ορολογικός έλεγχος των αναπνευστικών ασθενών για την επιβεβαίωση οξείας λοίμωξης από τον μικροοργανισμό έδειξε παρουσία υψηλών τίτλων IgM αντισωμάτων σε αναλογία 12,2% του συνόλου των ασθενών γεγονός που συνηγορεί για πρόσφατη λοίμωξη από το μικρόβιο, αλλά τα αποτελέσματα αυτά δεν επιβεβαιώθηκαν με ανίχνευση του μικροοργανισμού μοριακά. Ο ορολογικός έλεγχος των ασθενών με αθηρωμάτωση για την επιβεβαίωση χρόνιας ενεργού λοίμωξης από τον μικροοργανισμό έδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά της ανεύρεσης των IgA αντισωμάτων μεταξύ των ασθενών και μαρτύρων της μελέτης (79,3% και 67% αντίστοιχα, p=0,024). Αντίθετα η σχέση της συχνότητας των IgG αντισωμάτων μεταξύ ασθενών και μαρτύρων δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική (78,44% και 78,7% αντίστοιχα, p=1.000). Τα αποτελέσματα αυτά μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι τα IgA αντισώματα αποτελούν καλύτερο δείκτη ενεργού ή εμμένουσας λοίμωξης, σε αντίθεση με τα IgG που αποτελούν δείκτη παρελθούσας και η ανεύρεσή τους δεν βοηθά στο συσχετισμό του μικροοργανισμού με την αθηρωμάτωση. Ο μοριακός έλεγχος των ανιχνευθέντων μικροβίων στις αθηρωματικές πλάκες έδειξε την παρουσία του γενετικού υλικού του μικροοργανισμού σε 15 από αυτές (12,29%). Η μοριακή μελέτη έδειξε ότι η αμινοξική αλληλουχία των στελεχών CpnThessaloniki που ανιχνεύθηκαν παρουσιάζει 100% ομολογία με το στέλεχος J138 του C. pneumoniae (στέλεχος αναφοράς) και χαμηλότερα ποσοστά, με τα άλλα είδη της οικογένειας Chlamydiaceae. Περαιτέρω μοριακή ανάλυση των 15 στελεχών μας σε άλλη περιοχή του γονιδιώματος έδειξε ότι ανήκουν σε δύο διαφορετικούς τύπους CpnThessaloniki I και CpnThessaloniki II και διαφέρουν μεταξύ τους στην φορά κατεύθυνσης της περιοχής ygeD-urk, 23bp. Από την έρευνά μας φαίνεται ότι στην περιοχή της Β. Ελλάδας ο τύπος του μικροοργανισμού που επικρατεί είναι ο τύπος Ι. Συμπερασματικά από την εργασία αυτή προκύπτουν τα εξής: Ο μικροοργανισμός διακινείται στην περιοχή με αποτέλεσμα μια αναλογία 53,39% να διαθέτει αντισώματα έναντι αυτού. Όσον αφορά στις αναπνευστικές λοιμώξεις η συμμετοχή του είναι της τάξεως του 12,2%. Ανιχνεύθηκε στις αθηρωματικές πλάκες σε αναλογία 12,29% και η συμμετοχή του ως παράγοντα στην δημιουργία τους δεν αποκλείεται, ενισχύεται δε και από την ευρεθείσα στατιστικά σημαντική διαφορά της ύπαρξης IgA αντισωμάτων στους αθηρωματικούς ασθενείς σε σχέση με τους μάρτυρες. Μοριακά φαίνεται ότι δύο τύποι του C. pneumoniae διακινούνται στη Β. Ελλάδα με επικρατούντα τον τύπο Ι. Τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής μπορούν να αποτελέσουν βιβλιογραφικά δεδομένα για μελλοντικές έρευνες για τον μικροοργανισμό δεδομένου ότι μέχρι στιγμής δεν υπάρχουν αντίστοιχες για τον Ελλαδικό χώρο.