Μελέτη του βιολογικού ρόλου και της κατανομής των SR πρωτεϊνικών κινασών σε λευχαιμικά κύτταρα

Abstract

Serine/arginine protein kinases (SR-Protein Kinases) represent a novel class of enzymes that specifically phosphorylate RS or SR dipeptides. They show a remarkable specificity as mutations of Ser to Thr or Arg to Lys in the RS domain of their substrates, completely abrogate phosphorylation. SRPKs have been conserved throughout evolution and so far approximately 15 distinct genes encoding members of this family have been identified in the genomes of mammals, yeast, fruit fly, nematode, and plants. Mammalian SRPK1 was initially purified and cloned by Gui and Fu (1994), on the basis of its ability to phosphorylate members of the SR family of splicing factors in vitro. Since then, SRPK1 has been implicated in the regulation of multiple cellular processes such as chromatin structure, nuclear import and germ cell development. SRPK1a is an alternative spliced form of SRPK1 that contains an extended N-terminal domain of 171 aminoacids. SRPK1a is much less studied than its isoform SRPK1 and up to the present study it had only been detected in human testis. K562 cells have been used in the past as a model system to study CML. In addition, they contain high levels of SRPKs, while SRPK1 has been suggested to act downstream of BCR-Abl, in the same signalling pathway. Taken together these observations lead us to study SRPK1 and SRPK1a in leukaemic cells. Contrary to previous work showing cytoplasmic localization of SRPKs in HeLa cells, we demonstrate in the present study that SRPK1 and SRPK1a mainly partition between the nucleus and the Golgi apparatus in human and mouse leukemic cells. A fraction of the membrane-associated kinase is localised in detergent-resistant lipid rafts. Furthermore, hemin/DMSO or sodium butyrate-induced differentiation of K562 cells and hexamethylenebisacetamide (HMBA)-induced differentiation of MEL cells results in the exclusion of SRPKs from the cell nucleus and their accumulation at the Golgi membrane and the cytoplasm. Proapoptotic K562 cells, after short treatment with imatinib, also display a non-nuclear localization of SRPKs, similar to the one observed in differentiated cells. Moreover, we show that SRPK1 is the predominant isoform in K562 cells, with the expression ratio of the two isoforms being critical in determining cell fate. Stable overexpression of SRPK1a results in its accumulation at the Golgi membrane and the cytoplasm and induces erythroid differentiation of K562 cells. The induction of globin synthesis was accompanied by a marked decrease in proliferation and a significantly reduced clonogenic potential. These findings suggest that SRPK1a may play an important role in linking signaling to erythroid differentiation in human leukemic cells. In order to further probe into the biological roles of SRPKs in leukaemic cells, we studied the in vivo action of several quinoxaline derivatives that were found to selectively inhibit in vitro the phosphorylation activity of SRPK1. 2,3-di(thiophen-2-yl)benzo[g]quinoxaline and a yet uncharacterized compound (ID:14385) exhibited a strong apoptotic activity in K562 and MEL cells. Most interestingly, their action is restricted only against erythroleukaemic cells, whereas they show no effect on several other cancer cell lines, such as 293Τ, U87 και JM1 cells. K562 cells that overexpress SRPK1a show remarkable resistance against the apoptotic action of these inhibitors. This may be due either to the overexpression of the enzyme or the differentiation state of these cells. In line with the last hypothesis, we observed that hemin/DMSO-differentiated K562 cells show equal or even more persistent resistance against the apoptotic action of the same substances. In addition K562 cells overexpressing SRPK1a and hemin/DMSO-differentiated K562 cells were able to overcome the effect of other apoptotic inducers, such as imatinib. Taken together these data suggest that differentiation may activate an anti-apoptotic pathway in leukaemic cells.

Οι κινάσες πρωτεϊνών σερίνης-αργινίνης (SR-Protein Kinases) αποτελούν μια καινούργια οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν εξειδικευμένα SR ή RS διπεπτίδια. Η εξειδίκευση αυτών των ενζύμων είναι πολύ μεγάλη αφού μεταλλάξεις της σερίνης σε θρεονίνη ή της αργινίνης σε λυσίνη στην RS περιοχή των υποστρωμάτων τους, παρεμποδίζουν εντελώς την φωσφορυλίωση. Οι SRPKs είναι διατηρημένες στην εξέλιξη και έως τώρα έχουν απομονωθεί πάνω από 15 γονίδια που κωδικοποιούν μέλη αυτής της οικογένειας στο γένωμα των θηλαστικών, της ζύμης, της Drosophila, του C. elegans και των φυτών. Η SRPK1 αποτελεί το πρώτο μέλος της οικογένειας αυτής. Κλωνοποιήθηκε από τους Gui και Fu (1994) με βάση την ικανότητά της να φωσφορυλιώνει παράγοντες ματίσματος του mRNA που περιέχουν SR ακολουθίες στο μόριό τους. Έκτοτε, έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση αρκετών ακόμη διεργασιών μέσα στο κύτταρο, όπως η διαμόρφωση της δομής της χρωματίνης, η είσοδος πρωτεϊνών στον πυρήνα και η ανάπτυξη των σπερματικών κυττάρων. Η SRPK1a αποτελεί προϊόν εναλλακτικού ματίσματος του γονιδίου της SRPK1 και περιέχει μία εμβόλιμη ακολουθία 171 αμινοξέων στο Ν-τελικό της άκρο που δεν υπάρχει στην SRPK1. Η SRPK1a έχει μελετηθεί πολύ λιγότερο από την SRPK1 και έως την παρούσα εργασία είχε ανιχνευτεί μόνο στους ανθρώπινους όρχεις. Το γεγονός ότι τα Κ562 κύτταρα, που αποτελούν την πιο μελετημένη κυτταρική σειρά της χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας, εμφανίζουν σχετικά υψηλά επίπεδα SRPKs, σε συνδυασμό με την παρατήρηση ότι οι SRPKs πιθανά βρίσκονται στο ίδιο σηματοδοτικό μονοπάτι με την BCR-Abl έκαναν ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα τη μελέτη του βιολογικού ρόλου της ομάδας αυτής των ενζύμων στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα. Αντίθετα με προηγούμενες μελέτες, οι οποίες δείχνουν μία κυρίαρχη εντόπιση των SRPKs στο κυτταρόπλασμα κυττάρων HeLa, στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται μία κατανομή των SRPK1 και SRPK1a μεταξύ του πυρήνα και του συμπλέγματος Golgi, σε ανθρώπινα και ποντικίσια ερυθρολευχαιμικά κύτταρα. Ένα κλάσμα τις κινάσης μάλιστα, που εντοπίζεται σε μεμβρανικές δομές, βρίσκεται σε λιπιδικές μικροπεριοχές ανθεκτικές σε απορρυπαντικά. Επιπλέον, η επαγωγή της διαφοροποίησης των Κ562 κυττάρων με αιμίνη/DMSO ή βουτυρικό νάτριο, όπως και η επαγωγή της διαφοροποίησης των MEL κυττάρων με HMBA, οδηγεί στον αποκλεισμό των SRPKs από τον πυρήνα των κυττάρων και τον περιορισμό της εντόπισής τους στο σύστημα Golgi και το κυτταρόπλασμα. Αντίστοιχη κατανομή με τα διαφοροποιημένα κύτταρα έχουμε και στην περίπτωση της επαγωγής της απόπτωσης των Κ562 κυττάρων με imatinib. Παράλληλα με τα παραπάνω, δείξαμε ότι η SRPK1 είναι η κυρίαρχη ισομορφή στα Κ562 κύτταρα, ενώ ο λόγος της έκφρασης των δύο ισομορφών SRPK1a/SRPK1 αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για την τύχη του κυττάρου. Σταθερή υπερέκφραση της SRPK1a στα κύτταρα αυτά, οδηγεί στη συσσώρευση της στη μεμβράνη του Golgi και το κυτταρόπλασμα και στην επαγωγή της διαφοροποίησης των Κ562 κυττάρων προς ερυθροκύτταρα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης γ-σφαιρίνης, η οποία συνοδεύεται από αξιοσημείωτη μείωση του ρυθμού ανάπτυξης των κυττάρων και σημαντική ελάττωση της ικανότητάς τους να σχηματίζουν αποικίες. Τα δεδομένα αυτά μας οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η SRPK1a ίσως κατέχει ένα σημαντικό ρόλο στα μονοπάτια μεταφοράς σήματος που οδηγούν στη διαφοροποίηση προς ερυθροκύτταρα των ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων. Επεκτείνοντας τη μελέτη μας στο βιολογικό ρόλο των SRPKs στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα, θελήσαμε να καταγράψουμε την in vivo επίδραση σε Κ562 και MEL κύτταρα ενώσεων που αποτελούν in vitro αναστολείς της SRPK1. Δύο από τα παράγωγα της κινοξαλίνης που δοκιμάστηκαν, βρέθηκε ότι αποτελούν ισχυρό επαγωγέα της απόπτωσης τόσο των Κ562 όσο και των MEL κυττάρων. Μάλιστα η δράση τους αυτή είναι εκλεκτική μόνο απέναντι σε ερυθρολευχαιμικές σειρές. Τα Κ562 κύτταρα που υπερεκφράζουν την SRPK1a εμφανίζουν ανθεκτικότητα απέναντι στην κυτταροτοξική δράση των παραπάνω αναστολέων. Η ιδιότητά τους αυτή μπορεί να οφείλεται είτε στην υπερέκφραση του ενζύμου, είτε στο ότι τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν χαρακτήρα μερικώς διαφοροποιημένων κυττάρων. Στην τελευταία υπόθεση συνηγορεί το γεγονός ότι διαφοροποιημένα Κ562 κύτταρα με αιμίνη/DMSO παρουσιάζουν παρόμοια και ίσως μεγαλύτερη ανθεκτικότητα απέναντι στους ίδιους αναστολείς. Το γεγονός ότι τα διαφοροποιημένα Κ562 κύτταρα αλλά και αυτά που υπερεκφράζουν την SRPK1a εμφανίζουν ανθεκτικότητα απέναντι και σε άλλους κυτταροτοξικούς παράγοντες, όπως το imatinib, δείχνει ότι κατά τη διαφοροποίηση ίσως ενεργοποιείται ένας γενικότερος αντι-αποπτωτικός μηχανισμός.