Ο ρόλος του παράγοντα νέκρωσης όγκων (tumor necrosis factor, TNF) και του ινοβλάστη στις πνευμονικές παθήσεις

Abstract

Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) with the histopathologic pattern of UIP is a progressive and lethal pulmonary disease of unknown etiology. Despite the increased research focus, the accurate molecular mechanisms driving disease development remain largely unknown. This fact is also reflected by the inefficiency of current clinical practices to battle the disease, both at the level of prognosis and treatment. Careful observation of the fibrotic lung in combination with the failure of antiinflammatory and immunosuppressive factors to cure the disease, shifted research from the study of the immune parameters of the disease, towards the investigation of alternative molecular mechanisms that occur in alveolar epithelial cells and fibroblasts. Current research suggests that the mechanisms driving IPF reflect abnormal, deregulated wound healing, involving increased activity and possibly exaggerated responses by a spectrum of proinflammatory and profibrogenic factors that occur in sites of alveolar epithelial injury. Tumor Necrosis Factor (TNF) is a pleiotropic cytokine expressed by many cell types in response to infection or injury. TNF affects multiple responses that extend well beyond its well characterized pro-inflammatory properties to include diverse signals for cellular differentiation, proliferation and death; its functions can be both beneficial, as well as detrimental. Despite the apparent involvement of TNF in IPF development, research in the past few years failed to detect a specific role for TNF in the pathogenesis of IPF, while only isolated cases assessing anti-TNF efficacy for the treatment of the disease were reported in the literature. To decipher the role of TNF in the mechanisms underlying disease development and to explore the possible differential usage of its two forms as well as its two receptors, we used the Bleomycin-induced pulmonary fibrosis model and a series of genetically modified mice lacking components of TNF signaling. Transmembrane TNF expression was shown to be sufficient to elicit an inflammatory response, but inadequate for the transition to the fibrotic phase of the disease. Soluble TNF expression, further localized in apoptotic alveolar epithelial cells, was shown to be crucial for lymphocyte recruitment, a prerequisite for TGF-bl expression and the development of fibrotic lesions. These results suggest a primary detrimental role of soluble TNF in the pathologic cascade, separating it from the beneficial role of transmembrane TNF, and indicate the importance of assessing the efficacy of soluble TNF antagonists in the treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Moreover, specific blockade of soluble TNF would be predicted to abolish the detrimental pro-fibrotic effects of TNF, while maintaining sufficient host defense against infections. Although anti-TNF treatment is unlikely to cure the disease (as in the case of rheumatoid arthritis and Crohn’s disease), it would still offer symptomatic relief and quality of life improvement. IPF represents a multifactorial entity with the involvement of many genes and molecular pathways in disease’s pathogenetic mechanisms. In an attempt to discover novel genes and/or cellular pathways that modify the pathogenesis of the disease and to indicate new therapeutic targets, gene expression profiling of disease progression was performed with the use of DNÀ microarrays. After rigorous statistical analysis differentially expressed genes were compared with all publicly available expression profiles both from human patients and animal models, thus creating a prioritized gene list of high statistical significance, consisted of the most likely disease modifiers identified so far in pulmonary fibrosis. Two of these genes HIF-la and GSN were chosen for further study in BLM-induced fibrosis. Hypoxia, the lack of oxygen, can modulate alveolar epithelial cell homeostasis by promoting significant and adverse effects on epithelial function, including VEGF and surfactant protein production, disruption of cytoskeleton integrity, the triggering of apoptosis and the induction of inflammation. HIF-la is recognized as a master regulator of hypoxic signaling by activating gene transcription of genes encoding proteins that mediate the cellular adaptive response under hypoxic conditions. Using immunohistochemical techniques upregulated expression of HIF-la and its major gene target VEGF were confirmed in the lungs of BLM-injected mice. Moreover, with the use of tissue microarrays, HIF-la and p53 expression was investigated in lung samples from patients with IPF/UIP and COP/OP, two histopathologic patterns of pulmonary fibrosis with different clinical course and prognosis. HIF-la expression in IPF was localized to the apoptotic alveolar epithelium and not in fibroblast foci, in which decreased apoptosis was found at least in part due to increased expression of the anti-apoptotic bcl-2 gene. This pattern of HIF-la expression was not observed in COP samples that increased production of HIF-la was found both in the epithelium and in areas with active fibrosis (Masson bodies). The differential expression of the HIF-la-p53 apoptotic axis within fibroproliferative areas in IPF and COP lung may explain the differences in clinical course, prognosis or treatment responsiveness between these two interstitial lung diseases. GSN (GSN) is an actin-binding protein that modulates cytoskeletal dynamics and has been implicated in caspase-mediated apoptosis. Its expression has been found deregulated in various transformed states affecting cellular proliferation and motility. Increased GSN expression was detected in modeled pulmonary inflammation and fibrosis. Genetically modified mice lacking GSN were shown to be protected from the development of pulmonary inflammation and fibrosis due to impaired neutrophil infiltration and decreased epithelial apoptosis. Cellular dissection of disease development suggested caspase-3-mediated fragmentation of GSN as a marker of alveolar epithelial apoptosis and the primary pathogenetic insult of modeled pulmonary inflammation and fibrosis. Moreover, GSN expression was also examined in lung samples of 65 human IIP patients (IPF, f-, c-NSIP, COP) impeded in tissue microarrays (TMA). The increased expression of GSN in IPF’s and f-NSIP’s alveolar epithelium but not in c-NSIP and COP may explain or even predict the differences in disease progression and treatment responsiveness. Collectively, the data presented in the doctoral dissertation, revealed new aspects of TNF biology in the context of IPF, discriminating the beneficial action of the transmembrane form from the deleterious action of the soluble form, suggesting that specific pharmacological targeting of solTNF could be proved useful for the treatment of the disease. Moreover and for the first time in the literature, the data provide evidence for the involvement of hypoxia/HIF-la and the cytoskeleton/GSN in the pathogenesis of IPF, indicating new perspectives for the design of novel therapeutic strategies.

Η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (ΙΠΙ) με το ιστοπαθολογικό πρότυπο της συνήθους διάμεσης πνευμονίας (UIP), είναι μια προοδευτική και θανατηφόρος πάθηση των πνευμόνων, αγνώστου αιτιολογίας. Παρά το αυξημένο ερευνητικό ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια, οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που ευθύνονται για την ανάπτυξη της ίνωσης, παραμένουν εν πολλοίς άγνωστοι. Το γεγονός αυτό αντανακλάται και στην έλλειψη αποτελεσματικής αντιμετώπισης της νόσου από τις τρέχουσες κλινικές πρακτικές, τόσο σε επίπεδο πρόγνωσης όσο και σε επίπεδο θεραπείας. Η προσεκτικότερη παρατήρηση του ινωτικού πνεύμονα σε συνδυασμό με την αποτυχία των αντι-φλεγμονωδών και ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων να θεραπεύσουν τη νόσο, απομάκρυναν την ερευνητική προσπάθεια από τη μελέτη των ανοσολογικών παραμέτρων της νόσου και την κατεύθυναν στην αναζήτηση εναλλακτικών μοριακών μηχανισμών στους οποίους εμπλέκονται τα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα και οι ινοβλάστες. Οι πρόσφατες θεωρίες που προσπαθούν να εξηγήσουν την παθογένεια της ΙΠΙ, προτείνουν ότι υπεύθυνοι μηχανισμοί για την ανάπτυξη της ίνωσης αποτελούν οι απορυθμισμένοι μηχανισμοί επούλωσης τραύματος που ενεργοποιούνται μετά από επαναλαμβανόμενες βλάβες του πνευμονικού επιθηλίου. Ο Παράγοντας Νέκρωσης Όγκων (Tumor Necrosis Factor, TNF) είναι μια πλειοτροπική κυτταροκίνη που παράγεται από πολλούς κυτταρικούς τύπους ως απόκριση σε μολύνσεις και βλάβες. Πέρα από τη διεξοδικά μελετημένη προφλεγμονώδη ιδιότητα του, ο TNF σηματοδοτεί για μια πλειάδα, πολλές φορές αντικρουόμενων λειτουργιών, όπως είναι ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και ο θάνατος του κυττάρου. Παρά την εμφανή συμμετοχή του TNF στην ανάπτυξη και εξέλιξη της ΙΠΙ, οι έρευνες των περασμένων χρόνων δεν κατάφεραν να αποσαφηνίσουν τον ακριβή ρόλο του μορίου στις παθογενετικές διαδικασίες ενώ μόνο μεμονωμένες περιπτώσεις χρήσης αντι-TNF προσεγγίσεων για τη θεραπεία της νόσου έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία. Για να εξακριβωθεί η βιολογική δράση του TNF στους μηχανισμούς ανάπτυξης της ίνωσης και να εξεταστεί η διαφορική συμμετοχή των διαφόρων μορφών του καθώς και των υποδοχέων του, χρησιμοποιήθηκε το πειραματικό πρότυπο της ΙΠΙ επαγόμενο από Μπλεομυκίνη και μια σειρά διαγενετικών ποντικών που δεν διαθέτουν σημαντικά μόρια του σηματοδοτικού μονοπατιού του TNF. Έκφραση μόνο της μεμβρανικής μορφής του TNF ενώ είναι αρκετή για την ανάπτυξη φλεγμονωδών αντιδράσεων, δεν επαρκεί για τη μετάβαση στην ινωτική φάση της νόσου. Αντιθέτως, η διαλυτή μορφή του TNF, η οποία παράγεται από τα αποπίπτοντα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα, αποδείχτηκε αναγκαία για την ανάπτυξη ινωτικού ιστού, μέσω της αυξημένης συνάθροισης λεμφοκυττάρων στον πνεύμονα που προκάλεσε και την επακόλουθη αύξηση των επιπέδων έκφρασης του κύριου προ-ινωτικού παράγοντα, TGF-bl. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη ενισχύουν την ανάγκη αξιολόγησης της χρήσης αντι-TNF παραγόντων για τη θεραπεία της ΙΠΙ. Επιπλέον, ειδική απενεργοποίηση της διαλυτής μορφής του TNF θα έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της προ-ινωτικής δράσης του TNF διατηρώντας παράλληλα την ικανότητα επαγωγής ανοσίας έναντι σε μολύνσεις, μέσω της δράσης της μεμβρανικής μορφής του. Αν και μια τέτοια θεραπευτική προσέγγιση έναντι του TNF δεν αναμένεται να θεραπεύσει τη νόσο (όπως και με την περίπτωση της Ρευματοειδούς Αρθρίτιδας και της νόσου Crohn), θα μπορούσε να προσφέρει ανακούφιση και βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών. Η ΙΠΙ αποτελεί μια πολυπαραγοντική νόσο με τη συμμετοχή πολλών γονιδίων και μοριακών μονοπατιών στους παθογενετικούς μηχανισμούς. Σε μια προσπάθεια για την ανακάλυψη νέων σημαντικών γονιδίων που τροποποιούν την ινωτική διαδικασία και την ανάδειξη νέων θεραπευτικών στόχων, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική των DNA μικροσυστοιχιών (DNA microarrays) για την ανάλυση της έκφρασης χιλιάδων γονιδίων κατά την ανάπτυξη ίνωσης στο πειραματικό μοντέλο της νόσου. Ακολουθώντας εκτενή στατιστική ανάλυση, μια σειρά από γονίδια με διαφοροποιημένη έκφραση συγκρίθηκαν με λίστες γονιδίων της ήδη υπάρχουσας βιβλιογραφίας, προερχόμενες από μελέτες με μικροσυστοιχίες γενετικού υλικού τόσο σε ανθρώπους με ΙΠΙ όσο και στο πειραματικό μοντέλο, δημιουργώντας έτσι μια μοναδική λίστα με πιθανούς τροποποιητές της νόσου. Δύο από αυτά τα γονίδια ο HIF-la και η gelsolin (GSN) επιλέχθηκαν για περαιτέρω μοριακή μελέτη της δράσης τους στα πλαίσια της ΙΠΙ. Η υποξία, η έλλειψη δηλαδή οξυγόνου, μπορεί να τροποποιήσει την κυτταρική ομοιόσταση του κυψελιδικού επιθηλίου με την επαγωγή σημαντικών προστατευτικών αλλά και ανεπιθύμητων-βλαβερών λειτουργιών της επιθηλιακής λειτουργίας όπως η έκφραση του VEGF και η παραγωγή επιφανειοδραστικού παράγοντα (surfactant factor), η καταστροφή της ακεραιότητας του κυτταροσκελετού και η πυροδότηση της απόπτωσης, ενώ μπορεί να επάγει και διαδικασίες φλεγμονής. Ο HIF-la αναγνωρίζεται ως ο κυρίαρχος ρυθμιστικός παράγοντας της κυτταρικής υποξικής σήμανσης επάγοντας τη μεταγραφή γονιδίων στόχων τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που καθορίζουν την κυτταρική απάντηση στην υποξία. Χρησιμοποιώντας τεχνικές ανοσοϊστοχημείας επιβεβαιώθηκε η αυξημένη έκφραση του HIF-la καθώς και σημαντικών γονιδίων στόχων του όπως το γονίδιο VEGF τους πνεύμονες ποντικών με ίνωση. Επιπλέον με τη χρήση ιστικών μικροσυστοιχιών ερευνήθηκε ο ρόλος του HIF-la και του γονιδίου-στόχου του p53 στους πνεύμονες ασθενών με ΙΠΙ, στους οποίους αυξημένη έκφραση του παράγοντα παρατηρήθηκε σε αποπτωτικά επιθηλιακά κύτταρα και όχι στις ινοβλαστικές εστίες, οι οποίες εμφανίστηκαν ανθεκτικές στην απόπτωση εν μέρει λόγω της αυξημένης έκφρασης του αντιαποπτωτικού παράγοντα bcl-2. Το παραπάνω πρότυπο έκφρασης του HIF-la δεν παρατηρήθηκε στην περίπτωση μιας άλλης ιδιοπαθούς διάμεσης πνευμονοπάθειας της COP, όπου αυξημένη έκφραση του παράγοντα βρέθηκε τόσο σε επιθηλιακά κύτταρα αλλά και σε περιοχές ενεργού ίνωσης (Masson bodies), γεγονός που μπορεί να εξηγήσει εν μέρει και τις διαφορές που εμφανίζουν τα δυο αυτά πρότυπα πνευμονικής ίνωσης τόσο όσον αφορά στην παθογένεια της νόσου όσο και στη διαφορετική κλινική πορεία, πρόγνωση και ανταπόκριση στη θεραπεία. Η GSN είναι μια πρωτεΐνη που ανήκει στην κατηγορία των δεσμευτικών πρωτεϊνών της ακτίνης και ρυθμίζει τη δομή του κυτταρικού σκελετού ενώ η δράση της έχει εμπλακεί στους μηχανισμούς της απόπτωσης που συμμετέχουν οι κασπάσες. Η έκφραση της έχει βρεθεί απορυθμισμένη σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, επηρεάζοντας τον πολλαπλασιασμό και την ικανότητα κίνησης των κυττάρων. Αυξημένη έκφραση της GSN βρέθηκε σε δείγματα πνευμονικού ιστού από ποντικούς με ίνωση στο ζωικό πειραματικό πρότυπο της ΙΠΙ. Γενετικά τροποποιημένοι ποντικοί ώστε να μη διαθέτουν το γονίδιο της GSN, παρουσιάστηκαν ανθεκτικοί έναντι στην ανάπτυξη πνευμονικής φλεγμονής και ίνωσης, γεγονός που αποδόθηκε στην ελαττωματική διήθηση του πνεύμονα από ουδετερόφιλα και στο μειωμένο ρυθμό απόπτωσης των επιθηλιακών κυττάρων. Γενετική και κυτταρική ανάλυση των παθογενετικών μηχανισμών της νόσου, ανέδειξε την πρωτεολυτική διάσπαση της GSN από την κασπάση-3 ως δείκτη της απόπτωσης των κυψελιδικών κυττάρων και ως κύριο μηχανισμό υπεύθυνο για την ανάπτυξη πνευμονικής φλεγμονής και ίνωσης. Επιπλέον, η έκφραση της GSN μελετήθηκε και στους πνεύμονες ασθενών με διάφορες διάμεσες πνευμονοπάθειες όπως IPF, f-, c-NSIP, και COP, με τη χρήση ιστικών μικροσυστοιχιών. Η επιλεκτική έκφραση του μορίου από το κυψελιδικό επιθήλιο της IPF και της f-NSIP αλλά όχι και από αυτό της c-NSIP και COP, μπορεί να εξηγήσει ή ακόμα να προβλέψει τις διαφορές στην εξέλιξη της παθολογίας και την ανταπόκριση σε θεραπεία, που παρατηρούνται μεταξύ της IPF και της f-NSIP και της COP. Συγκεντρωτικά, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αποκαλύπτουν νέες πτυχές της βιολογίας του TNF στα πλαίσια της ΙΠΙ, διαχωρίζοντας τις ευεργετικές δράσεις της μεμβρανικής του μορφής από τις καταστρεπτικές συνέπειες της διαλυτής του μορφής, προτείνοντας την επιλεκτική στόχευση της τελευταίας σαν θεραπευτική προσέγγιση της ΙΠΙ, ενώ επιβεβαιώνουν ξεκάθαρα και για πρώτη φορά τη συμμετοχή της υποξίας και του HIF-la από τη μια μεριά και του κυτταρικού σκελετού και της GSN από την άλλη στην παθογένεια της ΙΠΙ, αναδεικνύοντας νέες προοπτικές για το σχεδίασμά καινοτόμων θεραπευτικών στρατηγικών.