Ανάπτυξη εμπεδησιομετρικών βιοαισθητήρων σε επιφάνειες τιτανίου και χρυσού για την άμεση παρακολούθηση της σύζευξης βιομορίων και την ανίχνευση salmonella typhimurium σε πραγματικά δείγματα

Abstract

CHAPTER 1: In the first chapter are described the advantages and limitations of impedimetricsensors based on Ti/TiΟₓΗᵧ architectures. Titanium oxide (titania) was potentiostatically formed onto titanium electrodes of 2 mm diameter, at 10 and 30 V in 1 Μ H₂SO₄. Their thickness was ellipsometrically determined 30 and 86 nm respectively and they are highly insulating with charge-transfer resistances in the megaohn range, as they were measured with electrochemical impedance spectroscopy under specific experimental conditions. Low voltage anodization (<10 V) results to amorphous TiO₂, where at higher applied voltages (>25 V), anatase is the predominant form. SEM images are indicative of quite smooth, compact coatings without any severe cracks. Titania films were further treated with sodium hydroxide to increase the population of hydroxyl groups onto the outer oxide layer. Various silanization procedures based on liquid and gas-phase anhydrous conditions were employed to produce amino-terminated surfaces. Using glutaraldehyde as a cross linker, avidin was immobilized by chemical bonding. All impedimetric measurements were performed using biotinylated dextran as the target analyte. The initial conductivity of titanium/titania electrodes, as it can be managed by means of the hydroxylation process (duration of chemical etching) as well as the silane layer are major factors affecting the performance of the resultant biosensors. Extended studies using electrochemical impedance spectroscopy provide important new insights into the mechanism of the signal transduction and the physical factors that control the nature of the measuring signal. CHAPTER 2: The development of an immunosensor for the direct probing of the interaction between a cysteine-modified synthetic peptide, which corresponds to the epitope cTnC-89-98 of troponin C, and its specific antibody is described. Following immobilization of the peptide onto gold electrodes through the formation of a self-assembled monolayer, the alteration of the interfacial properties of the electrodes upon peptide-antibody interaction was traced by faradaic electrochemical impedance spectroscopy (EIS) using a silicotungstic heteropolyacid, H₄SiO₄.12WO₃, as a redox probe. The electrochemical behaviour of the redox probe was evaluated with cyclic voltammetry and EIS. The effect of milk protein or 4-mercaptophenol, which were used as post-blocking agents, on the performance of the immunosensor, was investigated. Treatment with 4-mercaptophenol resulted in immunoeffective electrodes that successfully tested in anti-serum samples. An optimum dilution ratio of the samples, where the effect of the matrix on the measuring signal is negligible, was also determined. CHAPTER 3: In this chapter is described for first time the development of a faradaic impedimetric immunosensor for the detection of S. typhimurium in milk. Polyclonal anti-Salmonella was cross-linked, in the presence of glutaraldehyde, on gold electrodes modified with a single 11-amino-1-undecanethiol (MUAM) self-assembled monolayer (SAM) or a mixed SAM of MUAM and 6-mercapto-1-hexanol at a constant 1+3 proportion, respectively. The mixed SAM was also deposited in the presence of triethylamine, which was used to prevent the formation of interplane hydrogen bonds among amine-terminated thiols. The effect of the different surface modifications on both the sensitivity and the selectivity of the immunosensors was investigated. The alteration of the interfacial features of the electrodes due to different modification or recognition steps, was measured by faradaic Electrochemical Impedance Spectroscopy in the presence of a hexacyanoferrate(II)/(III) redox couple. A substantial amplification of the measuring signal was achieved by performing the immunoreaction directly in culture samples. This resulted in immunosensors with great analytical features, namely i) high sensitivity; the response of the immunosensors increases with respect to the detection time as a consequence of the simultaneous proliferation of the viable bacteria cells in the tested samples. ii) validity; the response of the immunosensors is practically insensitive to the presence of dead cells, iii) working simplicity; elimination of various centrifugation and washing steps, which are used for the isolation of bacteria cells from the culture. The proposed immunosensors were successfully used for the detection of S. typhimurium in experimentally inoculated milk samples. The effect of different post-blocking agents on the performance of the immunosensors in real samples was also examined.

1ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ: Στο παρόν κεφάλαιο περιγράφονται τα πλεονεκτήματα και οι περιορισμοί στη χρήση εμπεδησιομετρικών αισθητήρων που βασίζονται σε ανοδιωμένα ηλεκτρόδια του τύπου Ti/TiΟₓΗᵧ. Οι στιβάδες οξειδίου του τιτανίου (Ti/TiΟₓΗᵧ) αναπτύχθηκαν ποτενσιοστατικά σε ηλεκτρόδια τιτανίου διαμέτρου 2 mm σε 1 Μ H₂SO₄ με εφαρμογή ηλεκτρικής τάσης (στη συνέχεια αναφέρεται ως δυναμικό σχηματισμού, forming potential) 10,0 και 30,0 V. Το πάχος των στιβάδων του οξειδίου μετρήθηκε με ελλειψομετρία και βρέθηκε περίπου 30 και 86 nm αντίστοιχα. Σύμφωνα, με μετρήσεις φασματοσκοπίας ηλεκτροχημικής εμπέδησης, κάτω από συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες, οι στιβάδες παρουσίασαν διηλεκτρική συμπεριφορά με αντιστάσεις μεταφοράς φορτίου στην κλίμακα των ΜΩ. Σε χαμηλές τιμές δυναμικού σχηματισμού (<10 V ως προς ηλεκτρόδιο αναφοράς Ag/AgCl/3 M KCl), η ανοδίωση οδήγησε στην ανάπτυξη άμορφου TiO₂, ενώ σε υψηλότερες τιμές δυναμικών (>25 V ως προς αντισταθμιστικό ηλεκτρόδιο Pt) αναπτύχθηκαν κυρίως κρυσταλλικές μορφές ανατάση. Οι εικόνες μικροσκοπίας σάρωσης ηλεκτρονίων (SEM) έδειξαν ότι οι στιβάδες του οξειδίου είναι σχετικά λείες, συμπαγείς, χωρίς σοβαρές ρωγμές. Στη συνέχεια έγινε περαιτέρω κατεργασία των οξειδίων με διάλυμα υδροξειδίου του νατρίου (χημική εγχάραξη) με σκοπό την αύξηση του πληθυσμού των ελεύθερων ομάδων υδροξυλίου στην εξωτερική τους επιφάνεια. Η τροποποίηση της επιφάνειας των ηλεκτροδίων Ti/TiΟₓΗᵧ με άμινο ομάδες έγινε με σιλανοποίηση υγρής και αέριας φάσης χρησιμοποιώντας γ-αμινοπροπυλοτριμεαιθοξυσιλάνιο, ενώ η ακινητοποίηση της πρωτεΐνης αβιδίνης έγινε μέσω διασταυρούμενης σύνδεσης με γλουταραλδεΰδη. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας βιοτινυλιωμένη δεξτράνη ως αναλύτη. Η αρχική αγωγιμότητα των ηλεκτροδίων τιτανίου/οξειδίου τιτανίου (η οποία εξαρτάται από το μέσο και τη διάρκεια της χημικής εγχάραξης) καθώς και η ποιότητα των στιβάδων του σιλανίου βρέθηκαν ότι επηρεάζουν καθοριστικά τη λειτουργία των βιοαισθητήρων. Με την παρούσα μελέτη και μετρήσεις φασματοσκοπίας ηλεκτροχημικής εμπέδησης προέκυψαν σημαντικές πληροφορίες για το μηχανισμό ανάπτυξης του μετρούμενου σήματος και τους φυσικούς παράγοντες που ελέγχουν τη φύση και το μέγεθος αυτού. 2ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ: Στο παρόν κεφάλαιο περιγράφεται η ανάπτυξη ενός ανοσοαισθητήρα για την άμεση ανίχνευση της σύζευξης μεταξύ ενός συνθετικού πεπτιδίου και του ειδικού του αντισώματος. Το πεπτίδιο τροποποιήθηκε με κυστεΐνη (εισαγωγή -SH για την πρόσδεσή του σε επιφάνεια χρυσού) και αντιστοιχεί στον επίτοπο cTnC-89-98 της τροπονίνης C. Η ακινητοποίηση του συνθετικού πεπτιδίου πάνω στα ηλεκτρόδια χρυσού έγινε μέσω του σχηματισμού μιας αυτοδιατασσόμενης μονοστιβάδας. Η μεταβολή της εμπέδησης των ηλεκτροδίων (Au-πεπτιδίου) λόγω της αλληλεπίδρασης πεπτιδίου-αντισώματος ανιχνεύθηκε με φαρανταϊκή φασματοσκοπία ηλεκτροχημικής εμπέδησης, χρησιμοποιώντας ως οξειδοαναγωγικό «ανιχνευτή» το πυριτοβολφραμικό ετεροπολυοξύ H₄SiO₄·12WO₃. Η ηλεκτροχημική συμπεριφορά του οξειδοαναγωγικού «ανιχνευτή» μελετήθηκε με κυκλική βολταμμετρία και φασματοσκοπία εμπέδησης. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση στη συμπεριφορά του ανοσοαισθητήρα των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν για το μπλοκάρισμα των μη ειδικών θέσεων και συγκεκριμένα της πρωτεΐνης γάλακτος και της 4-μερκαπτοφαινόλης. Η κατεργασία των ηλεκτροδίων με 4-μερκαπτοφαινόλη οδήγησε σε βιοαισθητήρες, οι οποίοι δοκιμάστηκαν με επιτυχία σε δείγματα αντί-ορών. Επίσης, καθορίστηκε ένα βέλτιστος λόγος αραίωσης των δειγμάτων, στον οποίο είναι αμελητέα η επίδραση της μήτρας στο μετρούμενο σήμα. 3ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ: Σε αυτό το κεφάλαιο, περιγράφεται για πρώτη φορά η ανάπτυξη φαρανταϊκών εμπεδησιομετρικών ανοσοαισθητήρων για την ανίχνευση Salmonella Typhimurium σε δείγματα γάλακτος. Οι προτεινόμενοι βιοαισθητήρες αναπτύχθηκαν με την ακινητοποίηση πολυκλωνικών αντισωμάτων Salmonella Typhimurium πάνω σε ηλεκτρόδια χρυσού, τα οποία είχαν τροποποιηθεί με αυτοδιατασσόμενες μονοστιβάδες θειολών. Η αρχή λειτουργίας των προτεινόμενων βιοαισθητήρων βασίζεται στη μεταβολή της εμπέδησης των τροποποιημένων ηλεκτροδίων (χρυσός/θειόλη/αντίσωμα) λόγω της εκλεκτικής αλληλεπίδρασης συγκεκριμένων επιτόπων της κυτταρικής επιφάνειας των βακτηρίων Salmonella με τα ακινητοποιημένα αντισώματα στην επιφάνεια των βιοαισθητήρων. Σημαντικό πλεονέκτημα της προτεινόμενης μεθόδου αποτελεί το γεγονός ότι οι αναλύσεις πραγματοποιούνται με την άμεση εμβάπτιση των βιοαισθητήρων σε καλλιέργειες των υπό εξέταση δειγμάτων, δηλαδή, χωρίς να απαιτείται η όποια προκατεργασία του δείγματος. Έτσι αποφεύγεται μια σειρά χρονοβόρων σταδίων, τα οποία απαιτούνται για την απομόνωση και τον καθαρισμό των κυττάρων και προηγούνται κάθε ανάλυσης με τις έως τώρα χρησιμοποιούμενες τεχνικές (ELISA ή PCR). Οι προτεινόμενοι ανοσοαισθητήρες παρουσιάζουν άριστα αναλυτικά χαρακτηριστικά, όπως υψηλή ευαισθησία, αξιοπιστία (δεν ανταποκρίνονται στην παρουσία νεκρών κυττάρων) και απλότητα στη χρήση. Η δυνατότητα απευθείας εμβάπτισης των βιοαισθητήρων σε πραγματικά δείγματα καθιστά επίσης δυνατή τη χρησιμοποίησή τους σε επιτόπιες μετρήσεις, δημιουργώντας πρόσφορο έδαφος για μελλοντική εμπορική χρήση αυτών, όπως για παράδειγμα στη βιομηχανία γάλακτος.