Προστασία του μυοκαρδίου χωρίς δεσμίνη από τις αΒ - κρυσταλλίνη και HSP25 σε γενετικό πρότυπο μυοκαρδιοπάθειας

Abstract

The absence of the muscle-specific intermediate protein desmin leads to dilated cardiomyopathy, which is characterized by mitochondrial defects and significant cell death, as well as extensive fibrosis and calcification. In an attempt to elucidate the mechanism leading to the desmin deficient phenotype, we performed a proteomics analysis of mitochondria isolated from wild type and desmin null myocardium. Significant differences were found in acetate and ketone metabolism, in malate-aspartate shuttle, PDH complex, aminoacid metabolism, as well as respiration energy shuttling. We sought to investigate whether the mitochondrial abnormalities and consequently the desmin null cardiomyopathy could be improved the overexpression of the small heat shock proteins aB-crystallin and HSP25. We overexpressed the two proteins independently in the desmin deficient myocardium under the control of the αΜΗC promoter. The overexpression of the two proteins resulted in significant improvement of myocardial morphology, as demonstrated by reduction of fibrosis and calcification and the correction of ultrastructural defects, as mitochondrial swelling and destruction and irregular positioning and deterioration of myofibrils. Cardiac function was ameliorated to a significant degree HSP25 overexpression and to even higher extent by aBcrystallin overexpression, proven by the improvement of systolic function, the increase in posterior wall thickness and the reduction of r/h, an indicator of LV wall stress. In addition, in the of αΒ-crystallin overexpression, desmin null mice demonstrate a rate of 100% survival in an obligatory exercice swimming protocol, while under the same conditions, only 50% of desmin null mice survive. Also, αΒ-crystallin overexpression provides significant protection against reactive oxygen and nitrogen species, and more specifically against mitochondrial superoxide ion, as proven by tissue culture experiments with adult cardiomyocytes and CM-H2DCFDA and MitoSox Red staining. Similarly, αΒ-crystallin overexpression protects desmin null cardiomyocytes oxidative insults, such as hydrogen peroxide, as demonstrated by CMH2DCFDA staining. Moreover, αΒ-crystallin protects against the permeability increase of MPTP and the decrease of mitochondrial potential (?ψ), as demonstrated by staining of adult cardiomyocytes with TMRM. αΒ-crystallin and HSP25 may protect the desmin null myocardium by acting as molecular chaperons, by providing xiii antioxidant protection through their capacity to increase glutathione levels and by acting as pleiotropic anti-apoptotic molecules.

Η απουσία της µυοειδικής πρωτεΐνης ενδιάµεσων ινιδίων δεσµίνης οδηγεί σε διατατική µυοκαρδιοπάθεια, η οποία χαρακτηρίζεται από µιτοχονδριακές διαταραχές και κυτταρικό θάνατο καθώς και από εκτεταµένη ίνωση και ασβεστίωση του µυοκαρδίου. Προκειµένου να διασαφηνιστεί ο µηχανισµός που οδηγεί στο φαινότυπο απουσίας δεσµίνης, πραγµατοποιήθηκε πρωτεωµική ανάλυση µιτοχονδρίων από το φυσιολογικό µυοκάρδιο και από το µυοκάρδιο απουσίας δεσµίνης. Σηµαντικές διαφορές εντοπίστηκαν σε πρωτεΐνες που σχετίζονται µε το µεταβολισµό ακετικού οξέος και κετονοσωµάτων, στο µεταφορέα µαλικού-ασπαρτικού, στο σύµπλοκο PDH, στον µεταβολισµό αµινοξέων, στην αναπνοή και στη µεταφορά ενέργειας. Αναζητήθηκε να ελεγχθεί αν οι µιτοχονδριακές διαταραχές και συνεπώς η µυοκαρδιοπάθεια απουσίας δεσµίνης µπορεί να βελτιωθεί από την υπερέκφραση των µικρών θερµεπαγόµενων πρωτεϊνών, αΒ-κρυσταλλίνης και HSP25. Πραγµατοποιήθηκε υπερέκφραση των µικρών θερµεπαγόµενων πρωτεϊνών αΒ- κρυσταλλίνης και HSP25 ανεξάρτητα στο µυοκάρδιο χωρίς δεσµίνη υπό τον έλεγχο του υποκινητή της α βαριάς αλυσίδας της µυοσίνης (αMHC). Η υπερέκφραση τόσο της αΒ-κρυσταλλίνης, όσο και της HSP25 είχε ως αποτέλεσµα την υψηλού βαθµού βελτίωση της µορφολογίας του µυοκαρδίου, όπως προκύπτει από τη µείωση της ίνωσης και της ασβεστίωσης και την αναίρεση των διαταραχών υπερδοµής, όπως η διόγκωση και η βλάβη των µιτοχονδρίων καθώς και η άτακτη διευθέτηση και καταστροφή των µυοϊνιδίων. Η καρδιακή λειτoυργία θεραπεύθηκε σε σηµαντικό βαθµό στην περίπτωση της HSP25 και σε µεγαλύτερο βαθµό στην περίπτωση της αΒ- κρυσταλλίνης, όπως προκύπτει από τη βελτίωση της συστολικής λειτουργίας, την αύξηση του πάχους του οπίσθιου τοιχώµατος της αριστερής κοιλίας και τη µείωση της καταπόνησης που αυτό υφίσταται. Επίσης, στην περίπτωση της αΒ- κρυσταλλίνης, τα πρότυπα παρουσιάζουν 100% βιωσιµότητα σε πρωτόκολλο υποχρεωτικής άσκησης υπό µορφής κολύµβησης διάρκειας 24 ηµερών, ενώ στις ίδιες συνθήκες τα πρότυπα χωρίς δεσµίνη εµφανίζουν 50% βιωσιµότητα. Παράλληλα, η υπερέκφραση αΒ-κρυσταλλίνης προσδίδει σηµαντική προστασία έναντι των ελεύθερων ριζών οξυγόνου και αζώτου, όπως προκύπτει από πειράµατα καλλιεργειών ενήλικων µυοκαρδιοκυττάρων µε σήµανση µε τον ιχνηθέτη CM-H2DCFDA. Το ίδιο xi συµπέρασµα προκύπτει από τη µείωση του µιτοχονδριακού ανιόντος υπεροξειδίου µετά από σήµανση µε MitoSox Red. Οµοίως, η υπερέκφραση της αΒ-κρυσταλλίνης προστατεύει τα κύτταρα από την επίδραση οξειδωτικών ερεθισµάτων, όπως η επίδραση H202 επί της καλλιέργειας, όπως αποδεικνύεται από τη σήµανση µε τον ιχνηθέτη CM-H2DCFDA. Παράλληλα, η αΒ-κρυσταλλίνη προσδίδει προστασία έναντι της αύξησης της διαβατότητας του µιτοχονδριακού πόρου µεταβατικής διαβατότητας (MPTP) και της πτώσης του µιτοχονδριακού δυναµικού (?ψ), όπως προκύπτει από τη σήµανση ενήλικων µυοκαρδιοκυττάρων µε τον ποτενσιοµετρικό ιχνηθέτη TMRM. Τόσο η αΒ-κρυσταλλίνη όσο και η HSP25 ενδέχεται να προστατεύουν το µυοκάρδιο χωρίς δεσµίνη µέσω της δράσης τους ως µοριακών συνοδών, προσδίδοντας αντιοξειδωτική προστασία µέσω αύξησης των επιπέδων γλουταθειόνης και δρώντας ως πλειοτροπικά αποπτωτικά µόρια