Απομόνωση, χαρακτηρισμός και λειτουργική ανάλυση γονιδίων του κουνουπιού An.gambiae ως υποψήφιων υποδοχέων για τη μετάδοση του παρασίτου P.berghei

Abstract

Μalaria is one of the major health problems in the world, leading to about 400,000,000 cases per year, of which 2,000,000 result to death. Anopheline mosquitoes transmit the Plasmodium parasites, which cause the disease. Because only little is known about the interactions between the insect vector and the parasite, the aim of this study was to isolate potential receptors that are involved in the invasion of the mosquito midgut wall by the parasite. A’ PART : Isolation, characterization and functional analysis of the An.gambiae integrin β-subunit Initially the gene that codes for the β integrin subunit of the malaria vector An.gambiae (ΙΝΤΒ) was cloned. The mosquito and the Drosophila (βPS) orthologues share extensive structural similarities through-out the entire molecule. The most recognizable ones are the I/A domains which are responsible for the interaction of the receptor with the ligand, and the EGF-like repeats, known for their involvement in protein-protein interactions. Expression profile determination suggested that INTB is active during all developmental stages and in distinct body parts, including the head, the thorax, the midgut and the abdomen. The modulation of β integrin expression in different time points after blood meal ingestion, was also studied. No dramatic changes were observed, except at 48 hours after bloodfeeding when a threefold increase in transcript concentration was noted. Using the β-integrin antibody we produced, the protein was detected at the basolateral membranes of the midgut epithelial cells. The study of subcellular localization of the protein in mosquito midgut 24 hours after bloodfeeding showed the redistribution of integrin, possibly due to endocytosis processes. Also, after extensive analysis of the protein localization in guts dissected from mosquitoes killed at different time points after feeding with 4 blood infected with P.berghei, it was shown that it covers the surface of both ookinetes and young oocysts, and it was also found at high concentrations in the vicinity of the oocysts later in development. Due to these observations we proceeded to a detailed analysis of the interactions, on the molecular level, of β integrin with Plasmodium surface proteins which are expressed in different developmental stages of the parasite. Using the in vitro Yeast Two-Hybrid System, no such interactions were detected. B’ PART : Functional analysis of the An.gambiae extracellular matrix protein Laminin Several recent reports have implicated the involvement of the basal lamina surrounding the midgut in the binding of the Plasmodium ookinete. Whether this extracellular structure acts as a mere physical barrier that blocks parasite migration, also masking the parasite from the insect’s immune system, or whether specific developmental cues are provided through the intimate contact, which eventually lead to the induction of the transformation into an oocyst, is unknown. Initially, the subcellular localization of the mosquito Laminin protein, the main component of basal lamina was studied. In immunofluorescence microscopy experiments using infected mosquito midgets, laminin was detected covering the ookinete surface. Moreover it coated the mature oocysts protruding towards the haemolymph. Extensive analysis using Yeast Two-Hybrid System was undertaken in order to elucidate the molecular interactions of mosquito laminin with parasite surface proteins. It was shown that a subdomain (V) of γ1 laminin subunit strongly interacts with the ookinete surface protein CTRP (Circumsporozoite- and Thrombospondin-related adhesive protein [TRAP]-related protein). ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Η ελονοσία αποτελεί ένα από τα βασικότερα προβλήματα υγείας στον κόσμο, με την εμφάνιση 400.000.000 περιπτώσεων ετησίως, από τις οποίες 2.000.000 θα οδηγήσουν στο θάνατο. Οφείλεται στο παράσιτο του γένους Plasmodium το οποίο μεταδίδεται μέσω του κουνουπιού φορέα του γένους Anopheles. Καθώς ελάχιστα είναι γνωστά όσον αφορά τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ φορέα-παρασίτου, στόχο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η απομόνωση πιθανών υποδοχέων που εμπλέκονται στις διαδικασίες εισόδου του παρασίτου στο μεσεντερικό επιθηλιακό τοίχωμα του κουνουπιού . Α’ ΜΕΡΟΣ : Απομόνωση, χαρακτηρισμός και λειτουργική ανάλυση της β-υπομονάδας της ιντεγκρίνης του κουνουπιού An.gambiae Αρχικά απομονώθηκε το γονίδιο (ΙΝΤΒ) που κωδικοποιεί τη β-υπομονάδα της ιντεγκρίνης του κουνουπιού-φορέα της ελονοσίας Anopheles gambiae. Η πρωτεΐνη του κουνουπιού και το ορθόλογο μόριο βPS της Drosophila, έχουν συντηρημένη αρχιτεκτονική δομή καθ’ όλο το μήκος των μορίων τους. Τα κύρια κοινά χαρακτηριστικά τους αποτελούν οι περιοχές Ι/Α υπεύθυνες για την αλληλεπίδραση του υποδοχέα με το δεσμευτή, καθώς και οι επαναλήψεις τύπου-EGF (EGF : Epidermal Growth Factor) γνωστές για την εμπλοκή τους σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Πειράματα προσ-διορισμού του προτύπου έκφρασης έδειξαν ότι το γονίδιο ΙΝΤΒ είναι ενεργό σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια και σε διαφορετικά σωματικά τμήματα, όπως στο κεφάλι, στο θώρακα, στο μεσέντερο και στην κοιλιακή χώρα. Μετά από μελέτη συσχέτισης της έκφρασης της β-ιντεγκρίνης με τη λήψη αίματος από το κουνούπι, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στην έκφραση της πρωτεΐνης, εκτός στην περίπτωση των 48 ωρών μετά την αιματοφαγία που τα επίπεδα της έκφρασης τριπλασιάζονται. Με πειράματα ανοσο-ιστοχημείας χρησιμοποιώντας το αντίσωμα που παρασκευάστηκε έναντι της εξωκυττάριας περιοχής, η β-ιντεγκρίνη α-νιχνεύτηκε στη βασική και στις πλευρικές μεμβράνες των επιθηλιακών κυττάρων του μεσεντέρου. Η ανάλυση του υποκυτταρικού εντοπισμού της στο 2 μεσέντερο του κουνουπιού 24 ώρες μετά την αιματοφαγία έδειξε την ανακατανομή της από την πλασματική μεμβράνη στο κυτταρόπλασμα, πιθανόν λόγω διαδικασιών ενδοκύττωσης. Ακολούθησε εκτεταμένη μελέτη του κυτταρικού εντοπισμού της β-ιντεγκρίνης σε μεσέντερα κουνουπιών που είχαν θανατωθεί σε διαφορετικές χρονικές περιόδους μετά τη χορήγηση αίματος, μολυσμένου με το παράσιτο P.berghei. Όπως αποδείχθηκε, η ιντεγκρίνη καλύπτει ολόκληρη την επιφάνεια των οοκινετών και των νεαρών ωοκυστών, ενώ εντοπίζεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στην περιοχή των ωοκυστών κατά τη μετέπειτα ανάπτυξή τους. Οι μικροσκοπικές παρατηρήσεις αποτέλεσαν το έναυσμα για τη μελέτη, σε μοριακό επίπεδο, των αλληλεπιδράσεων της β-υπομονάδας της ιντεγκρίνης με πρωτεΐνες που εκφράζονται στην επιφάνεια του παρασίτου και προέρχονται από διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια. Με την εφαρμογή του in vitro Συστήματος των Δύο Υβριδίων του σακχαρομύκητα που χρησιμο-ποιήθηκε για το σκοπό αυτό δεν παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση με τις παραπάνω πρωτεΐνες. B’ ΜΕΡΟΣ : Λειτουργική ανάλυση της λαμινίνης του κουνουπιού An.gambiae. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε αρχικά ο υποκυτταρικός εντοπισμός της λαμινίνης του κουνουπιού, κύριου συστατικού της βασικής λεπίδας του μεσεντερικού επιθηλίου. Στα πειράματα ανοσο-ιστοχημείας που εφαρ-μόστηκαν σε μεσέντερα κουνουπιών μολυσμένα με διαφορετικά στάδια ανάπτυξης του παρασίτου, η λαμινίνη ανιχνεύθηκε στην επιφάνεια των οοκινετών, ενώ φαίνεται να περιβάλλει τις ώριμες ωοκύστεις καθώς αυτές προεξέχουν από το επιθηλιακό τοίχωμα προς την πλευρά της αιμολέμφου. Η εκτεταμένη ανάλυση των μοριακών αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης του κουνουπιού με επιφανειακές πρωτεΐνες του παρασίτου χρησιμοποιώντας το Σύστημα των Δύο Υβριδίων του σακχαρομύκητα απέδειξε την ισχυρή αλληλεπίδραση της υποπεριοχής (V) της γ1-υπομονάδας της λαμινίνης με την παρασιτική πρωτεΐνη CTRP.