Μοριακοί μηχανισμοί μνήμης και μάθησης στον οργανισμό Caenorhabditis elegans: ο ρόλος του καναλιού ASIC-1

Abstract

The work presented in the following pages focuses on the elucidation of the molecular mechanisms underlying neuronal plasticity and communication in the nematode Caenorhabditis elegans. Neuronal plasticity appears to be conserved among different species and can be observed through changes in animal’s behavior after certain experiences. The nervous system processes and integrates sensory input to generate both immediate responses and long-term changes in behavior. The nematode worm Caenorhabditis elegans displays a remarkable capacity for experience-induced changes in behavior and several such paradigms have been described so far. Modulation of behavior by past experience is a manifestation of the C. elegans learning capacity. Here, we report the identification of ASIC-1 as modulator of associative learning process. ASIC-1 is an acid sensing ion channel that conducts sodium ions and belongs to the degenerin/epithelial sodium channel superfamily with members ranging form nematode to mammals. We find that animals lacking ASIC-1 are defective in associative learning although they show normal sensory perception. To address the question of how this ion channel mediates associative learning we identified gene’s expression pattern. asic-1 is expressed in the 8 neurons that constitute the worm’s dopaminergic system. In a more detailed analysis we observed a punctuate distribution of ASIC-1 in membrane regions that confine with the presynaptic marker synaptobrevin. Therefore, we assume that ASIC-1 localizes at presynaptic terminals of dopaminergic neurons. The observation that the dopamine deficient mutant cat-2(e1112) also displays learning defects confirmed that dopamine is required for normal associative learning. Additionally, exogenous supply of dopamine or elimination of the DAT-1 dopamine transporter counterbalance the defects associated with ASIC-1 deficiency although ASIC-1 mutants synthesize normal levels of the neurotransmitter. Similarly, interruption of dopaminergic signaling by genetic ablation of neurons expressing asic-1 impairs associative learning, which is again restored by exogenous addition of dopamine. Removal of the dopamine receptors DOP-1 and DOP-2, but not DOP-3, recapitulates the effects of asic-1 deletion on associative learning. But what is the mechanism that ASIC-1 mediates during associative learning and how it modulates dopaminergic signaling? To address the aforementioned basic question we monitored the neurotransmitter release at dopaminergic synapses through FRAP experiments. We found that in the absence of ASIC-1 the activity of dopaminergic neurons is compromised. Thus, ASIC-1 functions in dopaminergic neurons to mediate normal dopaminergic signaling, necessary for associative learning in C. elegans. Our results reveal a novel role of DEG/ENaC ion channels in modulating neuronal communication by regulating the activity of dopaminergic synapses.

Στη συγκεκριμένη διατριβή παρουσιάζεται η μελέτη των μοριακών μηχανισμών που ορίζουν την πλαστικότητα στην επικοινωνία των νευρικών κυττάρων του νηματώδους Caenorhabditis elegans κατά τη διαδικασία της μνήμης και της μάθησης. Η πλαστικότητα του νευρικού συστήματος εμφανίζεται να είναι συντηρημένη ανάμεσα σε διαφορετικά είδη και παρατηρείται από την αλλαγή στη συμπεριφορά τους με βάση την προγενέστερη εμπειρία. Το νευρικό σύστημα υποδέχεται και επεξεργάζεται τα περιβαλλοντικά ερεθίσματα οδηγώντας αρχικά στην άμεση απόκριση του οργανισμού και κατόπιν σε μακροπρόθεσμες αλλαγές της συμπεριφοράς. Το νηματώδες σκουλήκι C. elegans παρουσιάζει αξιοσημείωτη πλαστικότητα στο νευρικό του σύστημα και κατά συνέπεια στη συμπεριφορά του, εμφανίζοντας μια σειρά από διαφορετικά τέτοια παραδείγματα. Η αλλαγή της συμπεριφοράς ενός οργανισμού με βάση την προγενέστερη εμπειρία αποτελεί την εκδήλωση του φαινομένου της μνήμης και της μάθησης. Από τη συγκεκριμένη προσπάθεια βρέθηκε ότι το κανάλι ιόντων νατρίου ASIC-1 αποτελεί ρυθμιστικό παράγοντα της ικανότητας του οργανισμού να εμφανίζει πλαστικότητα στη συμπεριφορά του. Το κανάλι ASIC-1 ενεργοποιείται από τη μείωση του εξωκυττάριου pH και είναι μέλος της υπεροικογένειας των DEG/ENaCs η οποία περιλαμβάνει μόρια που συναντώνται από το νηματώδη μέχρι και τον άνθρωπο. Βρέθηκε ότι το στέλεχος asic-1(ok415), που φέρει μια έλλειψη στο γονίδιο asic-1 εμφανίζει μειωμένη ικανότητα εξαρτημένης μάθησης (associative learning) ενώ η ικανότητα αντίληψης περιβαλλοντικών ερεθισμάτων παραμένει φυσιολογική. Για τη διερεύνηση του τρόπου με τον οποίο το συγκεκριμένο κανάλι συμμετέχει στη διαδικασία της μάθησης αναγνωρίστηκε το μοτίβο έκφρασης του γονιδίου asic-1. Βρέθηκε ότι εκφράζεται σε 8 νευρώνες του C. elegans οι οποίοι συνιστούν το ντοπαμινεργικό σύστημα του οργανισμού. Αναλύοντας λεπτομερώς την υποκυτταρική τοποθέτηση της πρωτεΐνης διαπιστώθηκε ότι εμφανίζεται σε στικτή διάταξη στη μεμβράνη των ντοπαμινεργικών νευρώνων. Πειράματα συνεντοπισμού με το συναπτικό μάρτυρα SNB-1 έδειξαν ότι το κανάλι ASIC-1 τοποθετείται στις προσυναπτικές περιοχές των ντοπαμιεργικών νευρώνων. Για τη διερεύνηση του ρόλου της ντοπαμίνης στην εξαρτημένη μάθηση ακολούθησε ανάλυση του μεταλλαγμένου στελέχους cat-2(e1112) το οποίο παρουσιάζει μειωμένη ικανότητα βιοσύνθεσης του νευροδιαβιβαστή. Το στέλεχος αυτό εμφανίζει όμοια προβλήματα μάθησης με το μεταλλαγμένο στέλεχος asic-1(ok415) επιβεβαιώνοντας τον κομβικό ρόλο της ντοπαμίνης στην παραπάνω διαδικασία. Αυτό διαπιστώνεται και από το γεγονός ότι εξωγενής χορήγηση ντοπαμίνης οδηγεί στη διάσωση του φαινοτύπου τόσο για το στέλεχος cat-2(e1112) όσο και για το στέλεχος asic-1(ok415), παρά το γεγονός ότι το τελευταίο παράγει ντοπαμίνη σε φυσιολογικά επίπεδα. Ομοίως, το διπλά μεταλλαγμένο στέλεχος για το ASIC-1 και το μεταφορέα ντοπαμίνης DAT-1 οδηγεί σε διάσωση του φαινοτύπου καθώς τα επίπεδα του νευροδιαδιβαστή είναι αυξημένα εξαιτίας της μεταλλαγής του DAT-1. Ακολουθώντας την αντίθετη προσέγγιση έγινε διακοπή της σηματοδότησης μέσω ντοπαμίνης. Έτσι, απαλοιφή των ντοπαμινεργικών νευρώνων αλλά και μεταλλαγή των υποδοχέων ντοπαμίνης οδηγεί σε φαινοτυπικές ανωμαλίες όμοιες με εκείνες του στελέχους asic-1(ok415). Ποιος είναι όμως ο μηχανισμός δράσης του καναλιού ASIC-1 για την εκδήλωση της μνήμης και της μάθησης; Προκειμένου να απαντηθεί το ερώτημα αυτό έγινε καταγραφή της ενεργότητας των ντοπαμινεργικών συνάψεων σε πειράματα FRAP. Βρέθηκε ότι η ενεργότητα των συνάψεων αυτών είναι μειωμένη στο στέλεχος asic-1(ok415). Έτσι, συμπεραίνεται ότι το κανάλι ASIC-1 δρα στις παραπάνω συνάψεις εξασφαλίζοντας την αυξημένη ενεργότητα και συνεπώς τη σηματοδότηση μέσω ντοπαμίνης που απαιτείται για τη διαδικασία της μνήμης και της μάθησης. Από την εργασία αυτή προκύπτει ένας νέος ρόλος για ένα μέλος των DEG/ENaCs στο νηματώδη, ενώ είναι η πρώτη φορά για οποιοδήποτε οργανισμό που ένα τέτοιο κανάλι συνδέεται με τη σηματοδότηση μέσω ντοπαμίνης κατά τη διαδικασία της μνήμης και της μάθησης.