Μελέτη του ρόλου των γονιδίων raf και ras στα κακοήθη νεοπλάσματα του παχέος εντέρου

Abstract

Colon cancer is one of the most common human tumors. There are approximately 1 million new cases of colorectal cancer annually world-wide, and about 500.000 deaths every year by the disease. Racial and ethnic differences as well as environmental influences are associated with differences in the incidence rates of the disease. Colorectal cancer is the result of a multistage process. Inactivation of the APC gene (Adenomatous Polyposis Coli), DNA methylation disturbances, activation of RAS oncogene, loss of DCC gene (deleted ιn colon cancer), inactivation through deletion of p53, the role of MMR mutagenesis genes as well as additional mutations are steps which induce tumor genesis and contribute to malignant behaviour. RAS family genes (RAS, NRAS, HRAS), in normal cells, are involved in many cellular processes, controlling cell proliferation and differentiation. The protein kinase Ras/Raf/MEK/MAPK cascade, through phosphorylation, catalyses the induction of mitogene signals in the cell nucleus, resulting in control of the cell cycle. Point mutations of KRAS codon 12 are strongly associated with its mutagenic activation. The RAF group of genes includes three proto-oncogenes, the ARAF1, RAF1 and BRAF. BRAF gene is located in chromosomal position 7q34 and is a functional gene. The encoded protein is a member of serine/threonine kinase proteins and is activated by the link GTP – Ras. It is involved in the induction of mitogen signals from the cellular membrane to the nucleus. Point mutations with inefficient mismatch repair may promote its oncogenic activation. It is involved in the cell cycle and in antiapoptotic activity. BRAF might be favorable mutation target since the encoded protein has constitutively higher kinase activity comparative to RAF1. The most common RAF mutation in colorectal cancer is V600E (exon 15) which converts a valine residue to glutamic acid at amino acid position 600 (previously reported as V599E) of the encoded protein and it represents more than 50% of the observed mutations whereas no coexistence of KRAS mutations was observed. The aim of the present study is to investigate the contribution of oncogenic BRAF mutations to colon cancer, the potential relation with KRAS mutations in the same group of cancer specimens and the unveiling of possible correlations with clinical and histopathological features of the examined tumors. In this study, direct sequencing was performed of exon 15 of the BRAF gene in 61 sporadic colorectal cancers, surgically excised. Every specimen was examined pathologically for conformation of the histology (adenocarcinomas). Also, personal and family medical history of the patients was recorded as well as demographic and clinical data. Major criterion was the sporadic nature of the tumors. For the detection of point mutations in BRAF and KRAS genes, polymerase chain reaction was used to amplify exon 15 and codon 12 respectively, using specific oligonucleotide primers. Direct sequencing was performed for exon 15 BRAF analysis, in all specimens, using automated analyzer [BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer]. For the detection of point mutations in KRAS codon 12, restriction fragment length polymorphism analysis was performed (RFLP) by using restriction endonuclease MvaI (Roche Diagnostics GmbH, Germany). DNA from the cancer cell line SW480 which harbored the KRAS codon 12 mutation in homozygous status was used as a positive control. Subsequently, randomly selected samples, positive for KRAS mutations after RFLP analysis, were sequenced and the initial results were confirmed. It was found that the coding sequence of exon 15 was perfectly conserved in all samples. No nucleotide exchange that could interfere by modifying the aminoacid sequence of the BRAF protein was detected. Molecular analysis for the detection of KRAS mutations was possible for 58 samples. Seventeen samples were positive for KRAS mutations. All KRAS mutations were detected in heterozygous state. Among the 17 tumors with KRAS codon 12 mutations, 12 (34,3%) were male cases (among 35 male cases examined) and 5 (21.7%) were women cases (among 23 women cases examined). Patients with age 70 years or younger were more commonly carriers of KRAS codon 12 mutations than older patients (>70 years), (P= 0.028, Pearson chi square test). Males between 61 and 70 years were more commonly carriers of KRAS mutations compared to younger or older patients, P= 0.040, Pearson chi square test). The 38.1% of the tumors located in the proximal colon (cecum, ascending colon, and transverse colon) and 24.3% of the tumors located in the distal colon (descending or sigmoid colon and rectum) harbored KRAS mutations respectively. The 20.0% of Dukes’ stage A and 28.6% of Dukes’ stage B tumors harbored KRAS mutations, while Dukes’ stage C and D tumors carried these mutations in rates of 34.6% and 27.3% respectively. Tumor stage was uncertain in two cases. The descriptive approach of these results reveals that Dukes stage C and D tumors harbored most of the observed mutations (over 60%). From 43 tumors of good and moderate differentiation, 27.9% were carriers of KRAS mutations, while from 8 tumors of poor differentiation, 37.5% were carriers of the same mutations (data available for 51 tumor samples). Finally, KRAS mutations were found in 25.6% of non-mucinous tumors examined and in 40% of mucinous tumors (data available for 44 tumor samples). The absence of BRAF mutations results perhaps, from environmental, ethnic differences or/and other molecular events. Sequencing of exon 15 and subsequent results make the possibility of methodological discrepancies unlikely. On the other hand, several studies report differences of BRAF mutation frequencies of wide range (5%-20%) from line to line, which presumably correlates, at least in part, with population differences due to environmental, ethnic or racial factors. KRAS mutations seem to remain “the common suspects” since their detection frequency, in the present study, is approximately 30%, which is in alignment with the international reports.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου θεωρείται από τα συχνότερα νεοπλάσµατα στον άνθρωπο. Περίπου 1.000.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου παχέος-ορθού εµφανίζονται, παγκοσµίως, κάθε χρόνο, ενώ περίπου 500.000 άνθρωποι καταλήγουν, ετησίως, λόγω της συγκεκριμένης κακοήθειας. Φυλετικές και εθνολογικές διαφορές καθώς και περιβαλλοντικές επιδράσεις σχετίζονται µε διαφορές στην επίπτωση του νεοπλάσματος. Ο καρκίνος παχέος–ορθού είναι το επιφαινόμενο μιας πολυσταδιακής διεργασίας. Η απενεργοποίηση του γονιδίου APC (Adenomatous Polyposis Coli), διαταραχές της µεθυλίωσης του DNA, η ενεργοποίηση των ογκογονιδίων RAS, η απώλεια του γονιδίου DCC (deleted in colon cancer), η αδρανοποίηση µέσω απάλειψης του p53, ο ρόλος των µεταλλακτικών γονιδίων MMR, αλλά και επιπρόσθετες µμεταλλάξεις, είναι βήµατα που επάγουν την καρκινογένεση και συνεισφέρουν στην κακοήθη συµπεριφορά. Η οικογένεια των RAS γονιδίων (KRAS, NRAS, HRAS), στα φυσιολογικά κύτταρα, έχουν πολλαπλές λειτουργίες ρυθµίζοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση. Ο καταρράκτης Ras/Raf/MEK/MAPK πρωτεϊνικών κινασών, µέσω µηχανισµού φωσφορυλίωσης, καταλύει την επαγωγή µιτωγόνων σηµάτων στον πυρήνα του κυττάρου, µε αποτέλεσµα τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Σηµειακές µεταλλάξεις του γονιδίου KRAS στο κωδικόνιο 12 σχετίζονται ισχυρά µε την ογκογόνο ενεργοποίηση του. Η οµάδα RAF γονιδίων περιλαµβάνει τρία πρωτο-ογκογονίδια, το ARAF1, το RAF1 και το BRAF. Το BRAF γονίδιο ανευρίσκεται στη χρωµοσωµική θέση 7q34 και είναι λειτουργικό γονίδιο. Η πρωτεΐνη, που κωδικοποιεί ανήκει στην κατηγορία πρωτεϊνών σερίνης-θρεονίνης κινάσης και ενεργοποιείται από το σύνδεσµο GTP – Ras. Εµπλέκεται στη µεταγωγή µιτωγόνων σηµάτων από την κυτταροπλασµατική µεµβράνη στον πυρήνα. Σηµειακές µεταλλάξεις µε ανεπαρκή επιδιόρθωση, µάλλον, βρίσκονται πίσω από την ογκογόνο ενεργοποίηση του. Εµπλέκεται στον κυτταρικό κύκλο ενώ φαίνεται να έχει και αντι-αποπτωτική δράση. Το BRAF, ίσως, είναι προτιµητέος στόχος µετάλλαξης αφού κωδικοποιεί πρωτεΐνη που χαρακτηρίζεται από υψηλότερη βασική δραστηριότητα κινάσης σε σχέση µε το RAF1. Η πλέον συνήθης µετάλλαξη του BRAF, στον καρκίνο παχέος-ορθού, είναι η V600E (εξώνιο 15) που χαρακτηρίζεται από αντικατάσταση βαλίνης µε γλουταµικό οξύ, στη θέση 600 (προηγουµένως βιβλιογραφικά αναφερόµενη σαν V599E), της πρωτεϊνικής µορφής που κωδικοποιεί και φαίνεται να συναντάται πάνω από το 50% των µεταλλάξεων που παρατηρήθηκαν ενώ σε καµία περίπτωση δε συσχετίστηκε µε συνύπαρξη µεταλλάξεων KRAS. Σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν η διερεύνηση της συνεισφοράς των ογκογονικών µεταλλάξεων του BRAF στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου, της δυνητικής τους σχέση µε µεταλλάξεις του KRAS στον ίδιο πληθυσµό καρκινικών δειγµάτων καθώς και η ανάδειξη πιθανών συσχετίσεων µε τα κλινικά και ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά των όγκων που εξετάστηκαν. Στα πλαίσια αυτής της µελέτης πραγµατοποιήθηκε απ’ ευθείας ανίχνευση της ακολουθίας βάσεων του εξωνίου 15 του γονιδίου BRAF σε 61 δείγµατα σποραδικών όγκων παχέος-ορθού, χειρουργικώς εξαιρεθέντων. Κάθε δείγµα εξετάστηκε παθολογοανατοµικά για την επιβεβαίωση της ιστολογίας του (αδενοκαρκινώµατα). Καταγράφησαν ατοµικό και οικογενειακό ιστορικό των ασθενών, δηµογραφικά και κλινικά στοιχεία. Μείζον κριτήριο αποτέλεσε η σποραδικότητα των όγκων. Για την ανίχνευση σηµειακών µεταλλάξεων στο γονίδιο BRAF και KRAS ενισχύθηκαν οι περιοχές του εξωνίου 15 και του κωδικονίου 12 αντίστοιχα µε την τεχνική της PCR µέσω της χρήσης κατάλληλων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών. Άµεσος έλεγχος της ακολουθίας των αλληλουχιών του εξωνίου 15 του BRAF πραγµατοποιήθηκε σε όλα τα δείγµατα µε αυτόµατο αναλυτή, σε κέντρο του εξωτερικού [BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer] ενώ για την ανίχνευση σηµειακών µεταλλάξεων του κωδικονίου 12 στο γονίδιο KRAS ακολουθήθηκε κατά κύριο λόγο ανάλυση πολυµορφισµού µεγέθους περιοριστικών θραυσµάτων (RFLP) µε τη χρήση περιοριστικής ενδονουκλεάσης MvaI (Roche Diagnostics GmbH, Germany). DNA από την καρκινική κυτταρική σειρά SW480 φέρουσα την οµόζυγη µετάλλαξη στο κωδικόνιο 12 του KRAS χρησιµοποιήθηκε ως θετικό σηµείο αναφοράς και ελέγχου. Ακολούθησε τυχαιοποιηµένος έλεγχος επιβεβαίωσης KRAS θετικών δειγµάτων µε άµεσο έλεγχο της ακολουθίας βάσεων του κωδικονίου 12. Βρέθηκε ότι η ακολουθία του εξωνίου 15 σε όλα τα δείγµατα ήταν υψηλά διατηρηθείσα ως προς το φυσιολογικό. Δεν ταυτοποιήθηκε καµία νουκλεοτιδική µεταβολή ή απόκλιση που θα µπορούσε να επιφέρει τροποποιήσεις στην αλληλουχία αµινοξέων σε επίπεδο BRAF πρωτεΐνης. Η τεχνική ανάλυση για την ανίχνευση KRAS µεταλλάξεων, στο κωδικόνιο 12 ήταν εφικτή σε 58 δείγµατα. Δεκαεπτά από τα 58 δείγµατα έφεραν τις εν λόγω µεταλλάξεις. Όλες οι KRAS µεταλλάξεις ήταν ετερόζυγες. Από τους 17 όγκους φέροντες τις KRAS µεταλλάξεις 12 (34.3%) προέρχονταν από άνδρες (από 35 που εξετάστηκαν συνολικά) και 5 (21.7%) από γυναίκες (από 23 που εξετάστηκαν συνολικά). Ασθενείς µε ηλικία 70 έτη ή νεότεροι έφεραν KRAS µεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12, συχνότερα από ότι οι ασθενείς ηλικίας άνω των 70 ετών (P= 0.028, Pearson chi square test). Επίσης ασθενείς ηλικίας µεταξύ 61 και 70 ετών ήταν πιο πιθανό να ‘φέρουν’ τις εν λόγω µεταλλάξεις σε σχέση µε άλλες ηλικιακές οµάδες (≤60 έτη ή >70 έτη), (P= 0.040, Pearson chi square test). Το 38.1% των όγκων µε εντόπιση στο τυφλό, ανιόν και εγκάρσιο ενώ το 24.3% των όγκων µε εντόπιση στο κατιόν κόλον και ορθό έφεραν µεταλλάξεις αντιστοίχως. Καρκινώµατα σε Dukes’ Α στάδιο και Dukes’ Β στάδιο έφεραν KRAS µεταλλάξεις σε ποσοστό 20.0% και 28.6% αντιστοίχως ενώ όγκοι σε Dukes’ C στάδιο και Dukes’ D στάδιο είχαν τις εν λόγω µεταλλάξεις σε ποσοστό 34.6% και 27.3% αντίστοιχα. Σε δύο µόνο περιπτώσεις δεν υπήρχαν επαρκή στοιχεία για το στάδιο κατά Dukes. Η περιγραφική προσέγγιση αυτών των αποτελεσµάτων αναδεικνύει ότι όγκοι σε στάδιο Dukes’ C και Dukes’ D έφεραν τις περισσότερες µεταλλάξεις (περίπου 60%). Από 43 καλά και µέτρια διαφοροποιηµένους όγκους το 27.9% έφερε KRAS µεταλλάξεις ενώ από 8 φτωχά διαφοροποιηµένους όγκους το 37.5% έφερε τις εν λόγω µεταλλάξεις (στοιχεία διαθέσιµα για 51 δείγµατα όγκων). Τέλος KRAS µεταλλάξεις βρέθηκαν στο 25.6% των µη βλεννοπαραγωγών όγκων που εξετάστηκαν και στο 40% των βλεννοπαραγωγών όγκων (στοιχεία διαθέσιµα για 44 δείγµατα όγκων). Η µη ανεύρεση BRAF µεταλλάξεων είναι, ίσως, προϊόν περιβαλλοντικών, εθνολογικών διαφορών ή και άλλων µοριακών φαινοµένων. Η αυτοµατοποιηµένη ανίχνευση της ακολουθίας βάσεων του εξωνίου 15 και τα αποτελέσµατα αυτής αποµακρύνουν ισχυρά την πιθανότητα παρεκκλίσεων λόγω µεθοδολογίας. Από την άλλη πλευρά, διάφορες βιβλιογραφικές αναφορές παρουσιάζουν συχνότητες BRAF µεταλλάξεων µε µεγάλο εύρος διακύµανσης (5% -20%) από σειρά σε σειρά, γεγονός που έµµεσα µπορεί να υποτεθεί ότι σχετίζεται, τουλάχιστον µερικώς, µε πληθυσµιακές διαφορές λόγω περιβαλλοντικών, εθνολογικών ή και φυλετικών παραγόντων. Οι KRAS µεταλλάξεις φαίνεται να παραµένουν οι «συνήθεις ύποπτοι» αφού η συχνότητα µε την οποία ανευρίσκονται, στην παρούσα µελέτη, είναι περίπου 30%, εύρηµα συµβατό µε τη διεθνή βιβλιογραφία.