Πλαστικότητα των ουδετεροφίλων και ρύθμιση της φλεγμονώδους απόκρισης

Abstract

Introduction: Neutrophils constitute integral components of innate immunity and major contributors to thromboinflammation and tissue damage. Neutrophil plasticity, i.e., the ability of the mature cells to acquire phenotypic heterogeneity and functional flexibility when exposed to different stimuli of the inflammatory microenvironment, has been recently recognized as a key aspect of their biology. The generation and release of neutrophil extracellular traps (NETs), chromatin structures decorated with active proteins, comprises a predominant expression of neutrophil plasticity. Numerous studies demonstrate the release of NETs (NETosis) as an important defense mechanism. However, recent data link dysregulation of the innate immune response, leading to marked NETosis, to the induction of inflammation and thrombosis. Severe SARS-CoV-2 infection (COVID-19) stands as a recently recognized example of a disease characterized by dysregulated immune response and increased release of NETs. It is associated with high rates of intubation, in-hospital mortality, and secondary complications, such as micro- and macro-thrombosis and pulmonary fibrosis, often reflecting the robust underlying processes of thromboinflammation and immunofibrosis. Krüppel-like factor 2 (KLF2) is a transcription factor linked with neutrophil-associated fibrosis and thromboinflammation. However, its role in COVID-19 remains elusive. Objectives: Considering the heterogeneity and complexity of the mechanisms that characterize the dysregulation of the immune response in severe COVID-19, combined rescue immunomodulatory treatment (COMBI) was applied for the first time on top of standard-of-care treatment (SOC), aiming to reduce the need for mechanical ventilation and mortality, in non-intubated patients with COVID-19-related severe respiratory failure (PaO2/FiO2 <100 mmHg). In the experimental part of this PhD thesis, the crosstalk between the neutrophil/NETs axis and human lung fibroblasts (LFs) was investigated, as well as the effect of plasma on LFs’ thrombotic and fibrotic potential, in the context of severe COVID-19. The possible correlation between the fibrotic activity of LFs and KLF2 expression in the COVID-19 environment was also explored. Concurrently, a comparative study of the clinical data from patients subjected to different immunomodulatory interventions was conducted, correlating the findings with the research results. The broader purpose of this research was the identification of potential future prognostic and therapeutic targets in immunofibrotic diseases with a similar pathogenetic background. Materials and methods: In the clinical part of the study, 4 groups of patients with severe respiratory failure (SRF), subjected to different treatment interventions, were analyzed and compared. Specifically, the effect of COMBI treatment, comprising inhaled DNase I, baricitinib, and tocilizumab, to dismantle NETs and inhibit JAK1/2 and IL-6 signaling, respectively, was studied. COMBI treatment was compared with SOC or immunomodulatory monotherapies against IL-1 (anakinra) or IL-6 (tocilizumab). In the translational-research component of the study, human lung fibroblasts (LFs) were isolated from patients undergoing diagnostic lung biopsy. In vitro stimulations of LFs were conducted using either plasma, obtained from treatment-naïve patients with severe COVID-19, or NET structures, isolated after in vitro incubation of healthy neutrophils with patients’ plasma (COV NETs). RT-qPCR, in-cell ELISA (Cytoblot), immunofluorescence microscopy, collagen measurement and functional wound healing assays were performed to evaluate the effect of COVID-19 environment (plasma or NETs) on LFs. In vitro inhibition studies were conducted, using the agents of COMBI protocol (DNase I, baricitinib, tocilizumab), to investigate the role of NETs, JAK1/2 and IL-6 signaling, respectively. Results: At the clinical level, COMBI treatment was associated with lower in-hospital mortality, reduced intubation rate, shorter duration of hospitalization, and prolonged overall survival, compared to other therapeutic interventions. At the experimental level, in vitro stimulation of LFs with COVID-19 environment induced the tissue factor (TF)/thrombin pathway, while pre-incubation with COMBI agents significantly inhibited this effect. Furthermore, upon incubation with COVID-19 plasma or COV NETs, LFs acquired a pre-fibrotic phenotype, characterized by increased expression of CCN2 (Cellular Communication Network Factor 2), a growth factor consistently associated with fibrotic remodeling, and increased collagen production. This effect was correlated with the down-regulation of KLF2 in LFs. However, pre-incubation of LFs with the agents of the COMBI protocol restored the reduced expression of KLF2, while mitigating their fibrotic activity. Plasma isolated from COMBI-treated patients at day 7 was characterized by a significantly reduced ability to induce the fibrotic potential of LFs (lower CCN2 expression and simultaneous restoration of the reduced expression of KLF2), compared to the plasma of SOC-treated patients. Conclusions: Collectively, COMBI rescue treatment was associated with improved clinical outcomes, compared to SOC therapy or immunomodulatory monotherapies. Severe COVID-19 environment induces the thrombotic and fibrotic potential of LFs through different pathways, including the neutrophil/NETs axis, JAK1/2 signaling, and IL-6. The dismantling of NETs by DNase I, and the subsequent inactivation of the mediators they contain, highlight, on one hand, the central role of NETosis, a process of neutrophil plasticity expression, in the thromboinflammatory and immunofibrotic process in COVID-19 and, on the other hand, the structural integrity of NETs as a prerequisite for maintaining their functionality. The in vitro results emerging from inhibition of the TF/thrombin axis and the fibrotic pathway in LFs are consistent with the above clinical observations, providing a plausible mechanistic explanation. Furthermore, the negative correlation between KLF2 expression and the fibrotic activity of LFs, suggests KLF2 as a significant regulator of the fibrotic process in severe COVID-19. Overall, the findings of this study hold potential for future applications in other acute or chronic inflammatory immunofibrotic conditions pathogenetically related to COVID-19.

Εισαγωγή: Τα ουδετερόφιλα αποτελούν βασικό συστατικό της έμφυτης/φυσικής ανοσίας (innate immunity) και κύριους επαγωγείς θρομβοφλεγμονής και ιστικής βλάβης. Η πλαστικότητα των ουδετεροφίλων, δηλαδή η ικανότητά των ώριμων μορφών τους να αποκτούν φαινοτυπική ετερογένεια και λειτουργική ευελιξία, όταν εκτίθενται σε διαφορετικά ερεθίσματα του φλεγμονώδους μικροπεριβάλλοντος, έχει πρόσφατα αναγνωρισθεί ως μια καίρια πτυχή της βιολογίας τους. O σχηματισμός και η απελευθέρωση των εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων/παγίδων χρωματίνης (neutrophil extracellular traps – NETs), διακοσμημένων με δραστικές πρωτεΐνες, συνιστά κύρια έκφραση της πλαστικότητας των ουδετεροφίλων. Πολυάριθμες μελέτες καταδεικνύουν την απελευθέρωση των NETs (ΝΕΤωση) ως σημαντικό μηχανισμό άμυνας. Ωστόσο, πρόσφατα δεδομένα συνδέουν την απορρύθμιση της φυσικής ανοσολογικής απόκρισης, που οδηγεί σε εκσεσημασμένη NETωση, με την επαγωγή της φλεγμονής και της θρόμβωσης. Η σοβαρή λοίμωξη από τον ιό SARS-CoV-2 (COVID-19) αποτελεί πρόσφατα αναγνωρισμένο παράδειγμα νόσου, που χαρακτηρίζεται από απορρυθμισμένη ανοσολογική απόκριση και αυξημένη απελευθέρωση NETs. Συνοδεύεται από υψηλά ποσοστά διασωλήνωσης, ενδονοσοκομειακής θνητότητας και απότοκων επιπλοκών, όπως οι μικρο- και μακρο-θρομβώσεις και η πνευμονική ίνωση, που συχνά αντικατοπτρίζουν την ισχυρή θρομβοφλεγμονώδη και ανοσοϊνωτική υποκείμενη διεργασία. Ο μεταγραφικός παράγοντας Krüppel-like factor 2 (KLF2) έχει συνδεθεί με την ίνωση και την θρομβοφλεγμονή που σχετίζεται με τα ουδετερόφιλα. Ωστόσο, ο ρόλος του στην COVID-19 παραμένει αδιευκρίνιστος. Σκοπός: Λαμβάνοντας υπόψιν την ετερογένεια και πολυπλοκότητα των μηχανισμών που χαρακτηρίζουν την απορρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης στην σοβαρή COVID-19, εφαρμόσθηκε, για πρώτη φορά, επιπλέον της καθιερωμένης θεραπευτικής προσέγγισης (standard-of-care – SOC), συνδυασμένη ανοσοτροποποιητική θεραπεία διάσωσης (COMBI), με στόχο την μείωση της ανάγκης για μηχανικό αερισμό και την αύξηση της επιβίωσης, σε μη διασωληνωμένους ασθενείς με COVID-19-σχετιζόμενη σοβαρή αναπνευστική ανεπάρκεια (PaO2/FiO2 <100 mmHg). Στο πειραματικό μέρος της παρούσας διδακτορικής διατριβής, μελετήθηκε η συνομιλία μεταξύ του άξονα ουδετεροφίλων/NETs και των ανθρώπινων πνευμονικών ινοβλαστών, καθώς και η επίδρασή του πλάσματος στο θρομβωτικό και ινωτικό δυναμικό αυτών, στα πλαίσια της σοβαρής COVID-19. Επιπλέον, διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση της ινωτικής δραστηριότητας των πνευμονικών ινοβλαστών με την έκφραση του KLF2 στο περιβάλλον της COVID-19. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη των κλινικών δεδομένων των ασθενών κατά την εφαρμογή διαφορετικών ανοσοτροποποιητικών παρεμβάσεων και συσχέτισή τους με τα ερευνητικά αποτελέσματα. Απώτερος σκοπός ήταν η ανάδειξη πιθανών μελλοντικών στόχων στην πρόγνωση και θεραπεία ανοσοϊνωτικών νοσημάτων με παρόμοιο παθογενετικό υπόστρωμα. Υλικά και μέθοδοι: Στο κλινικό μέρος της μελέτης, αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν 4 ομάδες ασθενών με σοβαρή αναπνευστική ανεπάρκεια (SRF), που υποβλήθηκαν σε διαφορετικές θεραπευτικές παρεμβάσεις. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση του πρωτότυπου θεραπευτικού πρωτοκόλλου διάσωσης COMBI, που περιλάμβανε συνδυασμό εισπνεόμενης DNase I, baricitinib και tocilizumab, για την αναστολή των NETs, της JAK1/2 σηματοδότησης και της IL-6, αντίστοιχα. Τα δεδομένα της συνδυασμένης θεραπείας COMBI συγκρίθηκαν με την SOC θεραπεία ή τις μονοθεραπείες έναντι της IL-1 (anakinra) ή της IL-6 (tocilizumab). Στο μεταφραστικό-ερευνητικό μέρος της μελέτης, απομονώθηκαν ανθρώπινοι πνευμονικοί ινοβλάστες (lung fibroblasts – LFs) από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε διαγνωστική βιοψία πνεύμονα. Οι in vitro διεγέρσεις στους LFs πραγματοποιήθηκαν είτε με πλάσμα ασθενών, που ελήφθη προτού λάβουν οποιαδήποτε θεραπεία, είτε με δομές NETs, που απομονώθηκαν κατόπιν in vitro επώασης υγιών ουδετεροφίλων με πλάσμα ασθενών (COV NETs). Για την αξιολόγηση της επίδρασης του COVID-19 περιβάλλοντος (πλάσμα ή NETs) στους LFs χρησιμοποιήθηκε RT-qPCR, in-cell ELISA (Cytoblot), μικροσκόπηση ανοσοφθορισμού, μέτρηση παραγωγής κολλαγόνου και λειτουργική δοκιμασία επούλωσης – κυτταρικής μετανάστευσης (wound healing assay). Στην συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν in vitro μελέτες αξιολόγησης αναστολέων, χρησιμοποιώντας τους παράγοντες του πρωτοκόλλου COMBI (DNase I, baricitinib, tocilizumab), ώστε να διερευνηθεί ο ρόλος της σηματοδότησης μέσω των NETs, της οδού JAK1/2 και της IL-6. Αποτελέσματα: Σε κλινικό επίπεδο, η θεραπεία COMBI συσχετίσθηκε με χαμηλότερη ενδονοσοκομειακή θνητότητα, μειωμένο ποσοστό διασωλήνωσης, μικρότερη διάρκεια νοσηλείας και παρατεταμένη συνολική επιβίωση, σε σύγκριση με τις υπόλοιπες θεραπευτικές παρεμβάσεις. Σε πειραματικό επίπεδο, η in vitro διέγερση των LFs με το περιβάλλον της COVID-19 επήγαγε την οδό του ιστικού παράγοντα (TF)/θρομβίνης, ενώ η εφαρμογή των ανοσοτροποποιητικών παραγόντων του COMBI ανέστειλε σημαντικά το φαινόμενο. Επιπλέον, έπειτα από επώαση με πλάσμα COVID-19 ή με COV NETs, οι LFs απέκτησαν προ-ινωτικό φαινότυπο, που χαρακτηρίσθηκε από αυξημένη έκφραση CCN2 (Cellular Communication Network Factor 2), αυξητικού παράγοντα που συσχετίζεται καθοριστικά με την ινωτική αναδιαμόρφωση, και από υψηλή παραγωγή κολλαγόνου. Το παραπάνω φαινόμενο συσχετίστηκε με την προς-τα-κάτω ρύθμιση (down-regulation) του KLF2 στους πνευμονικούς ινοβλάστες. Αντιθέτως, η προ-επώαση των LFs με τους παράγοντες του COMBI πρωτοκόλλου, αποκατέστησε την μειωμένη έκφραση του KLF2, μειώνοντας παράλληλα την ινωτική τους δραστηριότητα. Το πλάσμα των ασθενών 7 ημέρες μετά από θεραπεία με COMBI παρουσίασε σημαντικά μειωμένη ικανότητα επαγωγής του ινωτικού δυναμικού των LFs (δηλαδή μείωση της έκφρασης του CCN2 με σύγχρονη αποκατάσταση της μειωμένης έκφρασης του KLF2), συγκριτικά με το αντίστοιχο πλάσμα ασθενών της ομάδας που έλαβαν μόνο SOC. Συμπεράσματα: Η θεραπεία διάσωσης COMBI συσχετίσθηκε με βελτίωση της κλινικής έκβασης, σε σύγκριση με την SOC θεραπεία ή με τις μη-συνδυασμένες ανοσοτροποποιητικές θεραπείες. Το περιβάλλον της σοβαρής COVID-19 επάγει το θρομβωτικό και ινωτικό δυναμικό των LFs μέσω διαφορετικών μονοπατιών, συμπεριλαμβανομένου του άξονα ουδετερόφιλου/NETs, της σηματοδότησης μέσω JAK1/2 και της IL-6. Η αποδόμηση των NETs μέσω της DNase I, και η επακόλουθη αδρανοποίηση των μεσολαβητών που φέρουν, επισημαίνουν, αφενός, τον κεντρικό ρόλο της NETωσης, μιας διαδικασίας έκφρασης της ουδετεροφιλικής πλαστικότητας, στην θρομβοφλεγμονώδη και ανοσοϊνωτική διαδικασία της COVID-19 και, αφετέρου, την δομική ακεραιότητα των NETs ως απαραίτητη προϋπόθεση για την διατήρηση της λειτουργικότητάς τους. Τα in vitro αποτελέσματα που προκύπτουν από την αναστολή του άξονα TF/θρομβίνης και του ινωτικού μονοπατιού στους LFs συνάδουν με τις παραπάνω κλινικές παρατηρήσεις, προσφέροντας πιθανές μηχανιστικές ερμηνείες. Επιπλέον, η αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του KLF2 και της ινωτικής δραστηριότητας των LFs, προτείνει τον KLF2 ως σημαντικό ρυθμιστή της ινωτικής διεργασίας στην σοβαρή COVID-19. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δύνανται να αξιοποιηθούν μελλοντικά και σε άλλες, συναφείς παθογενετικά με την COVID-19, οξείες ή χρόνιες, φλεγμονώδεις ανοσοϊνωτικές καταστάσεις.