Συγκριτική φυσιολογική, μεταβολομική και μεταγραφωμική μελέτη της επίδρασης του στελέχους ριζοβακτηρίου Pseudomonas putida (SAESo11) σε σπορόφυτα τομάτας υπό καταπόνηση ξηρασίας

Abstract

The use of beneficial rhizobacteria that promote plant growth (PGPR, Plant Growth Promoting Rhizobacteria) represents a sustainable and environmentally friendly alternative to improve the efficiency of natural resource utilization while reducing the use of agrochemicals. Their integration into agricultural systems can enhance plants resilience against drought. The objective of this dissertation was to discover new potential PGPR strains and investigate in-depth the impact of the most effective strain, Pseudomonas putida SAESo11, on tomato seedlings under drought stress conditions. In summary, strain SAESo11 exhibited the ability to produce siderophores and IAA, solubilize phosphorus, form biofilm, produce EPS, exhibit swimming and swarming motility, and tolerate high sodium levels. Functional analysis of its genome revealed that a substantial number of genes are involved in fundamental functions related to bacterial survival, growth and competition with other soil bacteria, energy production, cell motility, the ability to interact with plants, the ability to respond to environmental changes, transcriptional regulation and the synthesis of compounds that could promote seedling growth under stressful conditions by improving nutrient availability. The ability of SAESo11 to alleviate the negative symptoms of drought in tomato seedlings was investigated through in vivo experiments, which included agronomic, physiological, and biochemical measurements as well as elucidation of its mechanism of action through metabolomic and transcriptomic analysis. Inoculation led to the accumulation of hydrogen peroxide (H2O2) and malondialdehyde (MDA), which served as signaling molecules that primed the seedlings to better respond to the subsequent stress. This effect, coupled with increased nutrients concentration and improved photosynthesis, contributed to a more efficient response to drought, while maintaining their growth and redox homeostasis. Furthermore, inoculation led to a less disturbed transcriptome of the aboveground part of the stressed seedlings, which exhibited reduced metabolic reprogramming and reduced accumulation of stress-related metabolites. Of particular interest was the identification of 55 DEGs due to inoculation under normal conditions, as well as the differential metabolic profile of the seedlings. Regulation of the redox state of the seedlings, more effective nitrogen assimilation, modifications in amino acid metabolism, regulation of phytohormones, and induction of the phenylpropanoid biosynthesis pathway were among the mechanisms employed by inoculated seedlings to cope with drought. Additionally, changes in pathways related to hormonal signaling in combination with the regulation of carbon metabolism under normal conditions, likely contributed to their preconditioned state. Aspartic acid, gamma-aminobutyric acid, glutamic acid, putrescine, genes CAT1, AS1, and AQPs as well as genes related to trehalose, tryptophan, and cysteine synthesis, appeared to be important molecules involved in the reprogramming process and potential biomarkers of the above-ground tissue for mediating SAESo11-induced priming. Subsequently, SAESo11 was capable of long-term biochemical processes modifications in the roots, with many metabolites accumulating differently under normal conditions. In particular, the accumulation of fructose, glucose, sucrose and xylose, as well as glutamic acid and putrescine, likely served as osmolyte reservoirs for the restoration of osmotic balance during stress. Meanwhile, organic acids accumulation may reflect the primed state of the seedlings for a faster and more effective response to drought. Furthermore, the expression of genes related to proline, glutamic acid, myo-inositol, threonine and polyamines was examined. The genes arginase (ARG1) and proline dehydrogenase (PDH) significantly increased their expression under normal conditions in the presence of SAESo11. ARG1 maintained high expression levels under drought conditions, while PDH reduced its expression. On the other hand, the genes myo-inositol oxygenase (MIOX), spermidine synthase (SPDS), and arginine decarboxylase (ADC) significantly increased their expression only during drought conditions in the presence of the strain, highlighting the role of myo-inositol and polyamines in drought tolerance. The metabolic reprogramming in both the aboveground and underground parts of the seedlings support their adaptation to drought conditions and reflects the symbiotic relationship between SAESo11 and the seedlings. The accumulation of sugars, amino acids, organic acids and putrescine was linked to the presence of the strain, and along with genes ARG1, PDH, SPDS and ADC they represent a reservoir of potential biomarkers for colonization and/or priming processes. Overall, the results of the present study support the role of SAESo11 strain in promoting tomato seedling growth under drought stress conditions. Further investigation of PGP traits of the strain, as well as of the involved priming mechanism, will contribute to our knowledge in the field of biostimulants, which are valuable assets in modern agricultural practices.

Η χρήση ωφέλιμων ριζοβακτηρίων που προωθούν της ανάπτυξη των φυτών (PGPR, Plant Growth Promoting Rhizobacteria) αποτελεί μια βιώσιμη και φιλική προς το περιβάλλον εναλλακτική πρακτική για τη βελτίωση της αποδοτικότητας της χρήσης των φυσικών πόρων και την μείωση της χρήσης αγροχημικών και η ενσωμάτωσή τους στο γεωργικό σύστημα μπορεί να αυξήσει την αντοχή των φυτών στην ξηρασία. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η ανεύρεση νέων εν δυνάμει PGPR στελεχών και η μελέτη της επίδρασης του δραστικότερου στελέχους Pseudomonas putida SAESo11 σε σπορόφυτα τομάτας υπό συνθήκες καταπόνηση ξηρασίας. Το SAESo11 είχε την ικανότητα να παράγει σιδηροφόρους και ΙΑΑ, να διαλυτοποιεί τον φωσφόρο, να δημιουργεί βιομεμβράνη, να παράγει εξωπολυσακχαρίτες, να έχει κολυμβητική και ομαδική κινητικότητα και να ανέχεται σημαντικά επίπεδα αλατότητας. Παράλληλα, στο γονιδίωμά του αναγνωρίστηκε μεγάλος αριθμός γονιδίων που εμπλέκονται σε βασικές λειτουργίες για την επιβίωση και την ανάπτυξη των βακτηρίων, τον ανταγωνισμό με άλλα βακτήρια, την παραγωγή ενέργειας, την κινητικότητα, την ανταπόκριση στις περιβαλλοντικές αλλαγές και την αλληλεπίδραση με τα φυτά, και τη σύνθεση ενώσεων ικανών να προάγουν την ανάπτυξη των φυτών υπό συνθήκες καταπόνησης μέσω της βελτίωσης της διαθεσιμότητας θρεπτικών. Η ικανότητα του SAESo11 να προωθεί την ανάπτυξη σποροφύτων τομάτας στην ξηρασία διερευνήθηκε μέσω του προσδιορισμού αγροκομικών, φυσιολογικών και βιοχημικών παραμέτρων και ο μηχανισμός δράσης του διευκρινίστηκε περαιτέρω μέσω μεταβολομικής και μεταγραφωμικής ανάλυσης. Ο εμβολιασμός προκάλεσε συσσώρευση του υπεροξειδίου του υδρογόνυο (H2O2) και της μαλονδιαλδεϋδης (MDΑ), λειτουργώντας ως σηματοδοτικά μόρια και θέτοντας τα σπορόφυτα σε κατάσταση ευαισθητοποίησης για ενισχυμένες αποκρίσεις. Η αυξημένη συγκέντρωση θρεπτικών και η βελτιωμένη φωτοσύνθεση των σποροφύτων συνέβαλαν στην αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση της ξηρασίας, διατηρώντας την ανάπτυξή και την οξειδοαναγωγική ομοιόστασή τους. Επιπλέον, ο εμβολιασμός οδήγησε σε λιγότερο διαταραγμένο μεταγράφωμα του υπέργειου τμήματος των σποροφύτων κατά την καταπόνηση, παρουσιάζοντας μικρότερο μεταβολικό επαναπρογραμματισμό και μειωμένη συσσώρευση μεταβολιτών που σχετίζονται με την καταπόνηση ξηρασίας. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον είχε ο εντοπισμός 55 διαφορικώς εκφραζόμενων γονιδίων λόγω του εμβολιασμού σε κανονικές συνθήκες, καθώς και το διαφοροποιημένο μεταβολικό προφίλ των σποροφύτων. Μεταξύ των μηχανισμών αντιμετώπισης της ξηρασίας που αναδειχθήκαν από την ανάλυση του υπέργειου τμήματος για τα εμβολιασμένα σπορόφυτα ήταν η ρύθμιση της οξειδοαναγωγικής κατάστασης, η αποτελεσματικότερη αφομοίωση του αζώτου, οι τροποποιήσεις στον μεταβολισμό των αμινοξέων, η ρύθμιση των φυτοορμονών και η επαγωγή της βιοσύνθεσης των φαινυλοπροπανοειδών. Επιπλέον, οι αλλαγές στα μονοπάτια που σχετίζονται με την ορμονική σηματοδότηση σε συνδυασμό με την ρύθμιση του μεταβολισμού του άνθρακα σε κανονικές συνθήκες, πιθανόν συνέβαλαν στην κατάσταση ευαισθητοποίησης των εμβολιασμένων σποροφύτων. Τέλος, το ασπαρτικό, το γ-αμινοβουτυρικό, το γλουταμικό, η πουτρεσκίνη, τα γονίδια της καταλάσης (CAT1), της συνθετάσης της ασπαραγίνης (AS1) και οι υδατοπορίνες (AQPs) καθώς και γονίδια που σχετίζονται με τη σύνθεση της τρεχαλόζης, της τρυπτοφάνης και της κυστεΐνης φάνηκε να αποτελούν μόρια που εμπλέκονται στον επαναπρογραμματισμό κα την SAESo11-επαγώμενη ευαισθητοποίηση για το υπέργειο τμήμα. Ακολούθως, το SAESo11 βρέθηκε να τροποποιεί μακροπρόθεσμα τις βιοχημικές διεργασίες στο υπόγειο τμήμα των φυτών, με πολλούς από τους μεταβολίτες να συσσωρεύονται διαφορετικά και υπό κανονικές συνθήκες. Συγκεκριμένα, η συσσώρευση των μεταβολιτών φρουκτόζη, γλυκόζη, σουκρόζη και ξυλόζη αλλά και το γλουταμικό οξύ και η πουτρεσκίνη, πιθανά εξυπηρετούν ως δεξαμενές οσμολυτών για την αποκατάσταση της οσμωτικής ισορροπίας στην επερχόμενη καταπόνηση, ενώ η συσσώρευση οργανικών οξέων πιθανά αντανακλά την κατάσταση ευαισθητοποίησης. Στην συνέχεια, ελέγχθηκε η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την προλίνη, το γλουταμικό οξύ, την μυο-ινοσιτόλη, την θρεονίνη και τις πολυαμίνες. Τα γονίδια αργινάση (ARG1) και αφυδρογονάση της προλίνης (PDH) αύξησαν την έκφρασή τους σε κανονικές συνθήκες παρουσία του SAESo11, το ARG1 διατήρησε τα υψηλά επίπεδα έκφρασης σε συνθήκες ξηρασίας, ενώ το PDH τα μείωσε. Από την άλλη, τα γονίδια οξυγενάση της μυο-ινοσιτόλης (MIOX), συνθάση της σπερμιδίνης (SPDS) και καρβοξυλάση της αργινίνης (ADC) αύξησαν σημαντικά την έκφρασή τους κατά την καταπόνηση μόνο παρουσία του βακτηρίου, επισημαίνοντας τον ρόλο της μυο-ινοσιτόλης και των πολυαμινών στην αντιμετώπισης της ξηρασίας. Ο εντοπιζόμενος μεταβολικός επαναπρογραμματισμός του υπόγειου τμήματος, μαζί με τον αυτόν του υπέργειου, υποστηρίζει την προσαρμογή των σποροφύτων στις συνθήκες ξηρασίας, αλλά και αντανακλά την συμβιωτική σχέση του βακτηρίου με τα σπορόφυτα. Η συσσώρευση των σακχάρων, των αμινοξέων, των οργανικών οξέων και της πουτρεσκίνης συνδέεται άμεσα με την παρουσία του βακτηρίου, και μαζί με τα γονίδια ARG1, PDH, SPDS και ADC συνιστούν μια δεξαμενή πιθανών βιοδεικτών για τις διαδικασίες του αποικισμού ή/και της κατάστασης ευαισθητοποίησης. Συνολικά, υποστηρίζεται ο ρόλος του στελέχους SAESo11, στην προαγωγή της φυτικής ανάπτυξης σποροφύτων τομάτας σε συνθήκες καταπόνησης ξηρασίας. Περαιτέρω διερεύνηση των PGP ιδιοτήτων του βακτηρίου καθώς και του μηχανισμού ευαισθητοποίησης θα ενισχύσουν τις γνώσεις μας στο πεδίο ανάπτυξης των βιοδιεγερτών, που αποτελούν πολύτιμα «εργαλεία» στη σύγχρονη γεωργική πρακτική.