Μηχανισμοί αντοχής πολυανθεκτικών στελεχών klebsiella pneumoniae σε τριτοβάθμιο ελληνικό νοσοκομείο

Abstract

Introduction: The observed dissemination of multidrug-resistant Gram-negative bacteria, including Klebsiella pneumoniae, is a global threat for the Public Health; the problem is higher in hospitalized patients, especially those in the intensive care units (ICUs). According to the latest report of European Center for Disease Control and Prevention (ECDC) for 2021, Greece presented the highest percentage (73.7%) of carbapenem-resistant K. pneumoniae (CRKP) among European countries. The most frequent mechanism of acquired carbapenem resistance is through the production of carbapenemases, especially K. pneumoniae carbapenemase (KPC), New Delhi metallo-blactamase (NDM), Verona Integron-Borne metallo-b-lactamase (VIM), imipenemase (IMP) and oxacillinase-48 (OXA-48). Virulence factors are the antigens the capsular polysaccharides, fimbriae, outer membrane proteins, and iron acquisition systems. The application of Next-Generation Sequencing (NGS) is a powerful tool for whole-genome sequencing (WGS) of bacteria, enabling the full genetic characterization of strains and the epidemiological relation of the strains.The aim of the thesis was the genetic characterization of multiresistant strains of K. pneumoniae isolated from ICU patients of a tertiary hospital and the identification of the genes that confer resistance to antibiotics, and especially to carbapenems. Material and Methods: The study included 150 CRKP isolates collected during June 2018 to July 2021from patients hospitalized in the adult ICU (116 isolates, 77.4%), the pediatric ICU (17 isolates, 11.3%) and the two neonatal ICUs (17 isolates, 11.3%) of Hippokration Hospital of Thessaloniki, Greece. The median age of the pediatric patients was 2 years (range 14 days–18 years), and that of the adult patients 66 years (range 19–92 years). In addition to phenotypic methods, a multiplex PCR was applied to detect the carbapenem resistance genes blaKPC, blaNDM, blaIMP and blaOXA-48-like; the protocol was modified by adding primers to detect also the blaVIM-1 gene. Descriptive and inferential statistical analysis was performed using the statistical package SPSS v. 22.0. NGS was applied om 24 representative CRKP isolates to obtain their whole genome sequence and perform genetic characterization. Among the 24 isolates, 18 were selected from the 150 strains of the overall study (to include isolates from all years and from all types of carbapenemases), while 6 additional isolates collected during December 2021 to June 2022 were also tested, as they were isolated from patients with septicemia and the cases presented clinical interest. The median age of the adult patients was 57.5 years (range 30–88), while the median age of children was 6.2 years (range 0.25–17). The sequence types (STs), plasmids, genes associated with regulatory and efflux pump systems, as well as the antimicrobial resistance genes, were identified using various software packages. The phylogenetic analysis based on the core genome single nucleotide polymorphisms (cgSNPs), and the construction of the phylogenetic tree were performed using bioinformatic programs (BRIG and REALPHY).Results: The most frequent carbapenemases were KPC and NDM (37.3 and 36.0%, respectively) with results of the immunoassay identical to those of the multiplex PCR. The blaNDM gene was mainly detected in adults (54/116, 46.9%), while in neonates and children the most frequent gene was blaKPC (24/34, 70.6%). In 2018-2019, the main mechanism of carbapenem resistance was the production of KPC, alone or in combination with VIM, while during 2020-2021 the NDM production was significantly higher (p < 0.001). Among the 150 isolates, the prevalence of genes conferring resistance to β-lactams was 100%, to aminoglycosides 79.2%, to quinolones 95.8%, to fosfomycin and tigecycline 33.3%, and to cotrimoxazole 87.5%. The most prevalent plasmid was IncF, which is associated with the spread of several extended-spectrum β-lactamase (ESBL) or carbapenemases genes; it was detected in all CRKP isolates. Additional plasmids (such as Col and IncC) were found in fifteen strains. The detected virulence factors included genes encoding for fibriae (of the mrk complex for fibriae type 3), for yersiniabactin (ybt, irp and fyuA), for the siderophore aerobactin (iut) and the kfu gene, which is a regulator of the iron transport system. Genes encoding the AcrAB efflux pump (acr, mar, sox, rob, ram, sdiA, fis and envR) or the OqxAB efflux pump (oqx and rar) were present in all strains. It was found that the 24 CRKP isolates belonged to eight different sequence types (STs): ST11 (7, 29.1%), ST39 (7, 29.1%), ST323 (3, 12.5%), ST15 (7, 29.1%), ST307 (1, 4.2%), ST30 (1, 4.2%), ST512 (1, 4.2%) and ST35 (1, 4.2%). Circular genome maps were generated for the four most frequent ST types (ST11, ST39, ST323 and ST15). A phylogenetic tree was constructed based on the cgSNPs of the isolates in relation to the reference strain. Of note that using NGS was identified the first case of neonatal sepsis due to a CAZ/AVI-resistant K. pneumoniae isolate producing KPC-2 and VEB-25. This fact led to the implementation of an adapted program of active surveillance in combination with infection control measures in the hospital.Conclusions: The present study provides data on the genetic characterization of CRKP isolates circulating in the ICUs of a Greek tertiary hospital, including evidence of the mechanisms conferring resistance to antibiotics, especially carbapenems. The phylogenetic analysis showed that some isolates were epidemiologically related. Since the NGS technology has become affordable, its application in hospital settings is extremely useful, since the obtained genetic data, combined with the temporal and spatial clonal distribution of isolates, can guide the design of timely and effective infection control measures to prevent the spread of multi-resistant bacteria.

Εισαγωγή: Η παρατηρούμενη εξάπλωση πολυανθεκτικών Gram-αρνητικών βακτηρίων, συμπεριλαμβανομένης της Klebsiella pneumoniae, αποτελεί παγκόσμια απειλή για τη Δημόσια Υγεία. Το πρόβλημα είναι μεγαλύτερο στους νοσηλευόμενους ασθενείς, ιδιαίτερα σε αυτούς που βρίσκονται στις μονάδες εντατικής θεραπείας (ΜΕΘ). Σύμφωνα με την τελευταία έκθεση του Ευρωπαϊκού Κέντρου Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (European Center for Disease Control and Prevention-ECDC) για το 2021, η Ελλάδα ήταν η χώρα με το υψηλότερο ποσοστό (73,7%) ανθεκτικών στην καρβαπενέμη στελεχών K. pneumoniae (CRKP). Ο πιο συχνός μηχανισμός επίκτητης αντοχής στις καρβαπενέμες είναι μέσω της παραγωγής καρβαπεμενασών, ιδιαίτερα της καρβαπενεμάσης K. pneumoniae (KPC), της μεταλλο-β-λακταμάσης Νέου Δελχί (NDM), μεταλλο-β-λακταμάσης Verona Integron-Borne (VIM), ιμιπενεμάσης (IMP) και οξακιλλινάσης-48 (OXA-48). Η παθογονικότητηα αυτών των στελεχών καθορίζεται από διάφορους λοιμογόνους παράγοντες, όπως τον λιποπολυσακχαρίτη της κάψας, τις φίμπριες, τις πρωτεΐνες της εξωτερικής μεμβράνης και τα συστήματα απόκτησης σιδήρου. Η εφαρμογή της αλληλούχισης επόμενης γενιάς (Next-Generation Sequencing-NGS) αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο για τη λήψη αλληλουχιών ολόκληρου του γονιδιώματος (Whole-Genome Sequencing-WGS) των βακτηρίων, δίνοντας τη δυνατότητα για τον πλήρη γενετικό χαρακτηρισμό των στελεχών και την επιδημιολογική συσχέτιση μεταξύ αυτών. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο γενετικός χαρακτηρισμός πολυανθεκτικών στελεχών K. pneumoniae απομονωθέντων από ασθενείς των ΜΕΘ τριτοβάθμιου νοσοκομείου και η ταυτοποίηση των γονιδίων που προσδίδουν αντοχή στα αντιβιοτικά, και κυρίως στις καρβαπενέμες.Υλικό και μέθοδοι: Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 150 στελέχη CRKP που συλλέχθηκαν από τον Ιούνιο του 2018 έως τον Ιούλιο του 2021 από ασθενείς που νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ ενηλίκων (116 στελέχη, 77,4%), την παιδιατρική ΜΕΘ (17 στελέχη, 11,3%) και τις δύο ΜΕΘ νεογνών (17 στελέχη, 11,3%) του Ιπποκράτειου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Η διάμεση ηλικία των παιδιατρικών ασθενών ήταν 2 έτη (εύρος 14 ημερών–18 ετών) και εκείνη των ενηλίκων ασθενών 66 έτη (εύρος 19–92 ετών). Εκτός των φαινοτυπικών μεθόδων, εφαρμόστηκε μία πολυπλεκτική PCR για την ανίχνευση των γονιδίων αντοχής στις καρβαπενέμες blaKPC, blaNDM, blaIMP και τύπου blaOXA-48. Το πρωτόκολλο τροποποιήθηκε με την προσθήκη εκκινητών για την ανίχνευση και του γονιδίου blaVIM-1. Πραγματοποιήθηκε περιγραφική και συμπερασματική στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο SPSS v. 22.0. Σε 24 αντιπροσωπευτικά στελέχη CRKP εφαρμόστηκε η μέθοδος NGS για τη λήψη αλληλουχιών ολόκληρου του γονιδιώματος των στελεχών και τον πλήρη γενετικό χαρακτηρισμό τους. Από αυτά, τα 18 επιλέχθηκαν από τα 150 στελέχη της συνολικής μελέτης (ώστε να περιλαμβάνονται στελέχη από όλα τα έτη και από όλους τους τύπους καρβαπενεμάσης), ενώ περιελήφθησαν 6 επιπλέον στελέχη που συλλέχτηκαν από τον Δεκέμβριο 2021 μέχρι τον Ιούνιο του 2022, διότι τα στελέχη αυτά απομονώθηκαν από ασθενείς με σηψαιμία και παρουσίαζαν κλινικό ενδιαφέρον. Η διάμεση ηλικία των ενηλίκων ασθενών ήταν 57,5 έτη (εύρος 30–88), ενώ η διάμεση ηλικία των παιδιών ήταν 6,2 έτη (εύρος 0,25–17). Οι τύποι αλληλουχίας (ST), τα πλασμίδια, τα γονίδια που σχετίζονται με τα ρυθμιστικά συστήματα και αντλιών εκροής, καθώς και τα γονίδια μικροβιακής αντοχής ταυτοποιήθηκαν με διάφορα λογισμικά πακέτα. Για τη φυλογενετική ανάλυση βασισμένη σε σημειακούς πολυμορφισμούς του γονιδιώματος του πυρήνα (core genome single nucleotide polymorphism, cgSNP) των στελεχών, και για την κατασκευή του φυλογενετικού δέντρου εφαρμόστηκαν προγράμματα βιοπληροφορικής (BRIG και REALPHY).Αποτελέσματα: Με την εφαρμογή της πολυπλεκτικής PCR βρέθηκε ότι οι συχνότερες καρβαπενεμάσες ήταν οι KPC και NDM (37,3 και 36,0%, αντίστοιχα) με αποτελέσματα ταυτόσημα με αυτά της ανοσοδοκιμασίας. Το γονίδιο blaNDM ανιχνεύθηκε κυρίως σε ενήλικες (54/116, 46,9%), ενώ σε νεογνά και παιδιά το πιο συχνό γονίδιο ήταν το blaKPC (24/34, 70,6%). Ο κύριος μηχανισμός αντοχής στις καρβαπενέμες κατά την περίοδο 2018-2019 ήταν η παραγωγή KPC μόνη της ή σε συνδυασμό με VIM, ενώ σημαντική επικράτηση της παραγωγής NDM παρατηρήθηκε κατά την περίοδο 2020-2021 (p <0,001). Ο επιπολασμός των γονιδίων που προσδίδουν αντοχή στις β-λακτάμες ήταν 100%, στις αμινογλυκοσίδες 79,2%, στις κινολόνες 95,8%, στη φωσφομυκίνη και την τιγεκυκλίνη 33,3% και στην κοτριμοξαζόλη 87,5%. Το πιο διαδεδομένο πλασμίδιο ήταν το IncF, το οποίο σχετίζεται με την εξάπλωση αρκετών γονιδίων β-λακταμάσης εκτεταμένου φάσματος (ESBL) ή καρβαπενεμασών, και ανιχνεύθηκε σε όλα τα στελέχη CRKP. Επιπλέον πλασμίδια (όπως Col και IncC), βρέθηκαν σε δεκαπέντε στελέχη. Οι παράγοντες λοιμογόνου δράσης που ανιχνεύθηκαν περιλάμβαναν γονίδια που κωδικοποιούν φίμπριες (του συμπλέγματος mrk για φίμπριες τύπου 3), γονίδια για την yersiniabactin (ybt, irp και fyuA), γονίδια που κωδικοποιούν το σιδεροφόρο αεροβακτίνη (iut) και γονίδιο kfu που είναι ρυθμιστής του συστήματος μεταφοράς σιδήρου. Γονίδια που κωδικοποιούν την αντλία εκροής AcrAB (acr, mar, sox, rob, ram, sdiA, fis και envR) ή την αντλία εκροής OqxAB (oqx και rar) ανιχνεύτηκαν σε όλα τα στελέχη. Τα 24 στελέχη CRKP ανήκαν σε οκτώ διαφορετικούς τύπους αλληλουχιών (ST): ST11 (7, 29.1%), ST39 (7, 29.1%), ST323 (3, 12.5%), ST15 (7, 29.1%), ST307 (1, 4.2%), ST30 (1, 4.2%), ST512 (1, 4.2%) και ST35 (1, 4.2%). Δημιουργήθηκαν κυκλικοί χάρτες γονιδιώματος του πυρήνα για τους τέσσερις πιο συχνούς τύπους ST (ST11, ST39, ST323 και ST15). Κατόπιν κατασκευάστηκε ένα φυλογενετικό δέντρο με βάση τους πολυμορφισμούς του γονιδίωματος του πυρήνα των στελεχών της μελέτης σε σχέση με το στέλεχος αναφοράς. Να σημειωθεί ότι με την εφαρμογή NGS αναγνωρίστηκε η πρώτη περίπτωση νεογνικής σήψης οφειλόμενης σε στέλεχος K. pneumoniae ανθεκτικού στο CAZ/AVI που παρήγαγε KPC-2 και VEB-25, γεγονός που οδήγησε σε εφαρμογή προσαρμοσμένου προγράμματος ενεργούς επιτήρησης σε συνδυασμό με μέτρα ελέγχου λοιμώξεων στο Νοσοκομείο.Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη παρέχει πληροφορίες για τον γενετικό χαρακτηρισμό στελεχών CRKP που κυκλοφόρησαν στις ΜΕΘ ενός ελληνικού τριτοβάθμιου νοσοκομείου κατά τη διάρκεια του διδακτορικού, συμπεριλαμβανομένων των μηχανισμών αντοχής στα αντιβιοτικά, και ιδιαίτερα στις καρβαπενέμες. Η φυλογενετική ανάλυση έδειξε ότι ορισμένα στελέχη παρουσίαζαν επιδημιολογική συσχέτιση. Δεδομένου ότι η τεχνική NGS έχει γίνει πλέον αρκετά προσιτή, η εφαρμογή της σε νοσοκομειακό περιβάλλον είναι εξαιρετικά χρήσιμη, καθώς τα γενετικά δεδομένα που λαμβάνονται, σε συνδυασμό με τη χρονική και χωρική κλωνική κατανομή των στελεχών, μπορούν να καθοδηγήσουν τον σχεδιασμό έγκαιρων και δραστικών μέτρων ελέγχου των λοιμώξεων για την καταπολέμηση της εξάπλωσης πολυανθεκτικών βακτηρίων.