Η επίδραση της ενεργοποίησης της κινάσης GCN2 σε ανθρώπινα σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα σε περιβάλλον φυσιολογικής και υψηλής γλυκόζης

Abstract

Diabetes mellitus is the seventh leading cause of death worldwide, with the annual number of diabetic patients rising. It is a multifactorial disease with microvascular and macrovascular complications that reduce both quality of life and life expectancy.Nephropathy is a microvascular complication of diabetes that causes a progressive decline in renal function and eventually leads to end-stage kidney disease. The most common microvascular glomerular lesions are nodular glomerulosclerosis, diffuse mesangial sclerosis, and capillary basal membrane thickening.Glomerular endothelial cells cannot reduce the expression of GLUT-1 transporter, resulting in increased glucose influx into the cytoplasm when the extracellular glucose concentration is high. This causes an increase in the production of free radicals, which results in DNA damadge. As a result, GAPDH is deactivated, and the normal glycolysis pathway is diverted towards the pathways of polyols, exosamin, PKC activation, and the production of Advanced glycation end products, AGEs.The by-products of the above-mentioned pathways, the increased production of ROS and proteinuria, lead to the stress of the Endoplasmic Reticulum. Many studies link the ER stress with the development and progression of kidney disease, regardless of whether it is attributed to primary glomerulonephritis, glomerular disease due to genetic mutations, diabetic nephropathy (DN), acute kidney damage, CKD or renal fibrosis.Taking into account the beneficial effects of protein restriction on diabetic nephropathy and the role of renal endothelium in its pathogenesis, the activated amino acid deprivation sensor, GCN2 kinase, was evaluated, on known harmful molecular pathways in human primary glomerular endothelial cells (GEnC) The GEnC cells were cultured under normal and high glucose conditions, in the presence or not of the GCN2 kinase activator, tryptophanol. The expression of glucose transporter 1 (GLUT1), the production of ROS, the activity of GAPDH, and the by-products of the diverted metabolic pathways of glycolysis were evaluated. It was found that high glucose concentration leads to the increased expression of GLUT1, increased ROS production and inhibited GAPDH. In addition, it increased the products of the polyol pathway, the PKC activity, the level of O-GlcNAc-modified proteins produced by the hexosamine pathway and the production of methylglyoxal, which is a precursor of AGEs. The supplementation of tryptophanol to the GEnC cell cultures restored the above changes caused by high glucose.Subsequently, the activity of SGLT2 transporters in primary human RPTECs cultivated in an environment of normal or high glucose concentration was evaluated, in the presence or not of the inhibitor of SGLT2 dapagliflozin. The aim was the evaluation of glucose consumption, free radical production (ROS), GAPDH activity, polyol pathway activity, hexosamine pathway activity, AGEs production, PKC activity, TGF-β1, interleukin-8 (IL-8), cell necrosis, and cell apoptosis.It was found that high glucose by increasing the expression of SGLT2 and glucose consumption leads to increased ROS production and inhibition of GAPDH. Inhibition of GAPDH leads to the accumulation of by-products of glycolysis due to the activation of harmful metabolic pathways. Eventually, these pathways lead to overproduction of TGF-β1 and IL-8, as well as to cell necrosis and apoptosis. The addition of dapagliflozin ameliorated the above facts.At the onset and progression of many diseases, the stress of the endoplasmic network is inextricably linked to the reduced state of redox.ER stress is linked to the onset and progression of many diseases, due to the reduced state of redox.The primary human renal epithelial cells (RPTCEs) were cultured in the absence of Tryptophan under low concentration of glucose, with or without the stress inducer of the ER stress Brefeldine-A. Cell proliferation, ROS production, onset of ER stress, activity of GCN2 kinase, apoptosis and autophagy were evaluated. It was found that the absence of Tryptophan was beneficial for cell survival during ER stress as the production of ROS decreased, autophagy increased and apoptosis decreased.

Ο σακχαρώδης διαβήτης είναι η έβδομη αιτία θανάτου παγκοσμίως με τον ετήσιο αριθμό των διαβητικών ασθενών να έχει αύξουσα πορεία. Πρόκειται για πολυπαραγοντικό νόσημα με μικροαγγειακές και μακροαγγειακές επιπλοκές που οδηγούν σε ελαττωμένη ποιότητα ζωής καθώς και μειωμένο προσδόκιμο επιβίωσης. Η νεφροπάθεια αποτελεί μια εκ των μικροαγγειακών επιπλοκών του διαβήτη που χαρακτηρίζεται από την προοδευτική μείωση της νεφρικής λειτουργίας και καταλήγει στην νεφρική νόσο τελικού σταδίου. Οι σημαντικότερες μικροαγγειακές σπειραματικές βλάβες είναι η οζώδης σπειραματοσκλήρυνση, η διάχυτη μεσαγγειακή σκλήρυνση και η πάχυνση της τριχοειδικής βασικής μεμβράνης.Τα σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα δεν μπορούν να ελαττώσουν την έκφραση του μεταφορέα GLUT-1, με αποτέλεσμα την αυξημένη η εισροή γλυκόζης στο κυτταρόπλασμα, όταν η εξωκυττάρια συγκέντρωσή της είναι υψηλή. Το γεγονός αυτό οδηγεί στην αυξημένη παραγωγή ελεύθερων ριζών που προκαλεί θραύσεις του DNA. Συνέπεια αυτού, είναι η απενεργοποίηση της GAPDH και η αναστολή της φυσιολογικής οδού της γλυκόλυσης, με προώθηση του μεταβολισμού της γλυκόζης προς τα μονοπάτια των πολυολών, των εξοζαμινών, την ενεργοποίηση του PKC και της παραγωγής προϊόντων μη ενζυματικής γλυκοζυλίωσης, AGEs. Τα παραπροϊόντα των προαναφερόμενων μονοπατιών, η αύξηση των ROS αλλά και η πρωτεϊνουρία, οδηγούν στο στρες του Ενδοπλασματικού Δικτύου και πολλές μελέτες συνδέουν το στρες του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ) με την ανάπτυξη και εξέλιξη της νεφρικής νόσου, ανεξαρτήτως εάν αποδίδεται σε πρωτοπαθή σπειραματονεφρίτιδα, σπειραματική νόσο λόγω γενετικών μεταλλάξεων, διαβητική νεφροπάθεια (ΔΝ), οξεία νεφρική βλάβη (ΟΝΒ), ΧΝΑ ή νεφρική ίνωση.Λαμβάνοντας υπόψη τις ευεργετικές επιδράσεις του περιορισμού των πρωτεϊνών στη διαβητική νεφροπάθεια αλλά και το ρόλο του νεφρικού ενδοθηλίου στην παθογένεια του, αξιολογήθηκε η επίδραση της ενεργοποιημένης GCN2 κινάσης, που είναι αισθητήρας στέρησης αμινοξέων, σε γνωστές επιβλαβείς μοριακές οδούς στα ανθρώπινα πρωτογενή σπειραματικά ενδοθηλιακά κύτταρα (GEnC). Τα GEnC καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες κανονικής και υψηλής γλυκόζης, παρουσία ή όχι του ενεργοποιητή κινάσης GCN2, τρυπτοφανόλη. Αξιολογήθηκε η έκφραση του μεταφορέα γλυκόζης 1 (GLUT1), η παραγωγή των ROS, η δραστηριότητα της GAPDH και τα προϊόντα των παράπλευρων μεταβολικών οδών της γλυκόλυσης. Διαπιστώθηκε ότι η υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης αυξάνοντας την έκφραση των GLUT1, οδηγεί σε υψηλή παραγωγή ROS και αναστολή της δραστηριότητα της GAPDH. Επιπλέον αύξησε τα προϊόντα του μονοπατιού των πολυολών, τη δραστηριότητα PKC, το επίπεδο των τροποποιημένων από το O-GlcNAc πρωτεϊνών που παράγονται από την οδό των εξοζαμινών και την παραγωγή μεθυλγλυοξάλης που είναι πρόδρομος των AGEs. Η προσθήκη τρυπτοφανόλης στα GEnC αποκατέστησε τις παραπάνω μεταβολές που προκλήθηκαν από την υψηλή γλυκόζη.Στην συνέχεια αξιολογήθηκε η δραστηριότητα των μεταφορέων SGLT2, σε πρωτογενή ανθρώπινα RPTECs που καλλιεργήθηκαν σε περιβάλλον φυσιολογικής ή υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης, παρουσία ή όχι του αναστολέα των SGLT2 δαπαγλιφλοζίνη. Σκοπός ήταν να αξιολογηθεί η κατανάλωση γλυκόζης, η παραγωγή ελευθέρων ριζών (ROS), η δραστηριότητα της GAPDH, η δραστηριότητα του μονοπατιού των πολυολών, των εξοζαμινών, της παραγωγής AGEs, η δραστηριότητα της PKC, ο TGF-β1, η ιντερλευκίνη-8 (IL-8), η νέκρωση των κυττάρων και η κυτταρική απόπτωση. Διαπιστώθηκε ότι η υψηλή γλυκόζη αυξάνοντας την έκφραση των SGLT2 και την κατανάλωση γλυκόζης οδηγεί στην αυξημένη παραγωγή ROS και την αναστολή της GAPDH. Η αναστολή της GAPDH οδηγεί στην συσσώρευση παραπροϊόντων της γλυκόλυσης λόγω ενεργοποίησης επιβλαβών μεταβολικών οδών. Τελικά, αυτά τα μονοπάτια οδηγούν σε υπερπαραγωγή TGF-β1 και IL-8, καθώς και σε νέκρωση των κυττάρων και απόπτωση. Η προσθήκη δαπαγλιφλοζίνης αποκατέστησε τα ανωτέρω γεγονότα. Κατά την έναρξη αλλά και την εξέλιξη πολλών ασθενειών, το στρες του ενδοπλασματικού δικτύου συνδέεται άρρηκτα με την μειωμένη κατάσταση οξειδοαναγωγής. Τα πρωτογενή ανθρώπινα νεφρικά επιθηλιακά κύτταρα εγγύς εσπειραμένων RPTCEs καλλιεργήθηκαν σε εμπλουτισμένο θρεπτικό υλικό που περιείχε χαμηλής συγκέντρωσης γλυκόζη απουσία τρυπτοφάνης και παρουσία ή όχι του επαγωγέα του στρες του Ενδοπλασματικού Δικτύου μπρεφελδίνης-Α. Αξιολογήθηκε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η παραγωγή ROS, η έναρξη του στρες του ΕΔ, η ενεργότητα της GCN2 κινάσης, η απόπτωση και η αυτοφαγία. Διαπιστώθηκε η ότι η απουσία Τρυπτοφάνης ήταν ευεργετική για την κυτταρική επιβίωση κατά το στρες του Ενδοπλασματικού δικτύου καθώς μειώθηκε η παραγωγή των ROS, αυξήθηκε η αυτοφαγία και μειώθηκε η απόπτωση.