Διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού που συσχετίζει την πρόκληση γενετικών αλλοιώσεων με την εκδήλωση ανοσολογικών αποκρίσεων στα μακροφάγα και το πάγκρεας

Abstract

Mutations in DNA repair genes have been correlated with a variety of human disorders with progeroid characteristics. This pinpoints the intertwined relation between the accumulation of DNA damage and the progression of ageing. Inflammation usually functions as the intermediate in the aforementioned process reflecting the efficiency of genome integrity maintenance. Even though, DNA damage, inflammation, tissue degeneration and ageing have been extensively studied, the underlying mechanisms mediating their interactions, still remain elusive.In order to investigate the previously mentioned functional relation, we used a mouse model with progeroid features. Because of an ERCC1-XPF DNA repair defect, which are proteins that participate in the Nucleotide Excision Repair pathway, the Ercc1-/- mice develop a severe phenotype that includes growth retardation, blindness, deafness, neurodevelopmental disorders and premature death, which is mostly attributed to liver malfunctions. However, extensive characterization of their phenotype that is also comprised of cachexia and metabolic disorders, prompted us to study their pancreas. More specifically, we show that the accumulation of DNA damage in pancreatic cells leads to loss of pancreatic architecture, activation of pancreatic stellate cells and creation of a dense collagen fibril network, including inflammatory features and fibrosis.What is more, Ercc1-/- pancreatic cells develop senescence related features but show no apoptotic signs. On a molecular basis, RNA-seq analysis revealed an overrepresentation of inflammatory processes including type I interferon response.This response appeared to be attributed to the presence of DNA:RNA hybrids which lead to the release of single stranded DNAs in the cytoplasm of pancreatic cells. Simultaneously, we observed an increase of DNA:RNA hybrids in the nucleus and accumulation of ssDNAs in the cytoplasm of pancreas and liver of normally aged mice, accompanied by an inflammatory response,, mimicking a viral-like infection.Attempting to shed light on the R-loop resolution mechanism, by defining the proteins that mediate it, we identified XPF, XPG, RNAse H and TOP1 as R-loop interactors in Ercc1-/- pancreas. Furthermore, we studied the release of the ssDNAs from the nucleus, where they are produced, to the cytoplasm, as well as the role of RPA70, which is the protein mediating the release. Finally, in order to ameliorate the inflammatory response, we used extracellular vesicles which transfered the S1 nuclease and RNAse H nucleases in Ercc1-/- pancreatic cells. The same set-up was applied in Ercc1-/- mice, injected with exosomes, carrying the aforementioned cargo. These experiments showed a decrease of the DNA:RNA hybrids and cytoplasmic ssDNAs, decrease of the inflammatory load of the pancreas and repression of pancreatic stellate cell activation. Thus, DNA damage-driven ssDNA moieties causally contribute to tissue degeneration with advancing age, paving the way for novel rationalized intervention strategies against age-related chronic inflammation.

Βλάβες σε γονίδια επιδιορθωτικών μηχανισμών του γονιδιώματος έχουν συσχετιστεί με ποικιλία ανθρώπινων ασθενειών με χαρακτηριστικά προγηρίας, υποδηλώνοντας με αυτό τον τρόπο την αλληλένδετη σχέση της συσσώρευσης βλαβών στο γονιδίωμα με τη γήρανση. Άμεσα συσχετιζόμενη είναι και η εμφάνιση φλεγμονής, λειτουργώντας αφενός ως διαμεσολαβητής και αφετέρου αντικατοπτρίζοντας το βαθμό εκφυλισμού του γονιδιώματος. Αν και μεμονωμένα όλα τα παραπάνω είναι γνωστά, η λειτουργική σύνδεση και κατ’ επέκταση οι εμπλεκόμενοι μηχανισμοί που συνδέουν τις γενετικές αλλοιώσεις, τη χρόνια φλεγμονή, τον ιστολογικό εκφυλισμό και την προγηρία δεν έχουν διασαφηνιστεί. Για να διερευνήσουμε την παραπάνω λειτουργική σχέση, μελετήσαμε το πάγκρεας ενός μοντέλου ποντικού με χαρακτηριστικά προγήριας. Στα συγκεκριμένα ζώα, λόγω απαλοιφής της ενδονουκλεάσης ERCC1 από όλους τους ιστούς, η οποία εμπλέκεται στον επιδιορθωτικό μηχανισμό εκτομής νουκλεοτιδίων, εμφανίζονται φαινοτυπικά χαρακτηριστικά που συμπεριλαμβάνουν καθυστέρηση στην ανάπτυξη, νανισμό και πρόωρο θάνατο, ο οποίος έχει αποδωθεί κυρίως σε ανωμαλίες στο συκώτι του ζώου. Ωστόσο, εκτενέστερη μελέτη του φαινοτύπου και προσπάθεια για χαρακτηρισμό της καχεξίας και των μεταβολικών διαταραχών που παρουσιάζονται, μας οδήγησαν στη μελέτη αλλοιώσεων σε ιστούς όπως το πάγκρεας. Πιο συγκεκριμένα, δείχνουμε ότι η συσσώρευση γενετικών αλλοιώσεων στα κυψελιδικά κύτταρα του παγκρέατος οδηγεί στην απώλεια της αρχιτεκτονικής του, στην ενεργοποίηση των αστεροειδών κυττάρων, τα οποία επάγουν την παραγωγή του κολλαγόνου και άλλων συστατικών της θεμέλιας ουσίας, όπως οι μεταλλοπρωτεάσες και οι αναστολείς τους, στην αύξηση του δικτύου των ινών κολλαγόνου και στην εμφάνιση φλεγμονωδών χαρακτηριστικών και ίνωσης στον ιστό. Επιπλέον, τα παγκρεατικά κύτταρα του Ercc1-/- ζώου εμφανίζουν χαρακτηριστικά κυτταρικής γήρανσης, αλλά όχι απόπτωσης. Σε μοριακό επίπεδο, τα αποτελέσματα RNA-seq ανάλυσης έδειξαν υπεραντιπροσώπευση διαδικασιών που σχετίζονται με την φλεγμονή και την ενεργοποίηση ιντερφερονών τύπου 1 στον συγκεκριμένο ιστό, γεγονός που συνδέθηκε με τη δημιουργία DNA:RNA υβριδίων, τα οποία οδηγούν στην απελευθέρωση και τη συσσώρευση μονόκλωνων DNA μορίων στο κυτταρόπλασμα των παγκρεατικών κυττάρων. Κατ΄αντιστοιχία, παρατηρήθηκε η συσσώρευση DNA:RNA υβριδίων στον πυρήνα και μονόκλωνων DNA μορίων στο κυτταρόπλασμα κυττάρων του παγκρέατος και του συκωτιού ηλικιωμένων ζώων, προκαλώντας μία ανοσολογική απόκριση που προσομοιάζει ιική μόλυνση, λόγω της επαγωγής των mRNA επιπέδων της ιντερφερόνης α και γονιδίων που σχετίζονται με την έκφραση αυτής. Επιπρόσθετα, προσδιορίστηκαν πρωτεΐνες όπως η XPF, XPG, RNΑse H και TOP1, οι οποίες αλληλεπιδρούν με τα DNA:RNA υβρίδια και μπορούν να συμμετέχουν ή να υποβοηθούν την αποκοπή τους. Μελετήθηκε ο μηχανισμός απομάκρυνσης των μονόκλωνων DNA από τον πυρήνα όπoυ δείχτηκε ότι παράγονται, στο κυτταρόπλασμα καθώς και ο ρόλος της πρωτεΐνης RPA70, η οποία συμμετέχει ενεργά στην παραπάνω διαδικασία. Τέλος, με σκοπό τη μείωση της φλεγμονής χρησιμοποιήθηκαν εξωκυττάρια κυστίδια τα οποία μετέφεραν τις νουκλεάσες S1 και RNΑse H σε Ercc1-/- παγκρεατικά κύτταρα. Αντίστοιχα, ενέσεις σε Ercc1-/- ποντίκια με τα παραπάνω κυστίδια οδήγησαν σε μείωση των DNA:RNA υβριδίων και των κυτταροπλασματικών μονόκλωνων DNA μορίων, ελαττώνοντας τη φλεγμονώδη απόκριση. Επομένως, τα συγκεκριμένα μονόκλωνα DNA τμήματα οδηγούν στον ιστολογικό εκφυλισμό με το πέρασμα της ηλικίας, όπως επίσης μπορούν να στοχευθούν για την ανάπτυξη θεραπειών έναντι της χρόνιας φλεγμονής κατά την προγηρία.