Μελέτη εγκλεισμού συστατικών τροφίμων σε κυκλοδεξτρίνες

Abstract

Cyclodextrins (CDs) are well known cyclic oligosaccharides, constituted by d-glucopyranose unitsconnected through α→(1,4) glucosic bonds, having the shape of a truncated cone endowed with ahydrophilic outer periphery and a hydrophobic interior cavity. Due to their shape and amphiphilicproperties, CDs have the ability to encapsulate hydrophobic molecules or parts of molecules, insidetheir cavity, forming non-covalent dynamic inclusion complexes in aqueous solution. In this casecyclodextrins are regarded as “hosts” whereas the encapsulated molecules as “guests”.The most common CD, used as a host molecule, is the native β-cyclodextrin (β-CD) consisting ofseven glucose units. β-CD methylated derivatives, like DM-β-CD [heptakis(2,6-di-O-methyl)-β-cyclodextrin] and TM-β-CD [heptakis(2,3,6-tri-O-methyl)-β-cyclodextrin), obtained by methylationof the β-CD hydroxyl groups in 2, 6 and 2, 3 and 6 positions respectively, are also commonlyexamined as pertinent hosts, as they offer an elongated hydrophobic cavity, higher solubility and inthe case of TM-β-CD more flexibility upon an induce-fit complexation mechanism with the guestmolecule.In this thesis, a thorough structural study of the following thirteen inclusion complexes is presented:Cholesterol/β-CD, Naringenin/DM-β-CD, Naringenin/TM-β-CD, Capsaicin/β-CD, Capsaicin/DM-β-CD, Piperine/β-CD, Piperine/DM-β-CD, Piperine/TM-β-CD, Arachidonic/TM-β-CD, Oleic/β-CD,Linoleic/β-CD, Myrcene/β-CD and Tyrosol/DM-β-CD. The encapsulated molecules cover a variety ofchemical categories, such as steroids (cholesterol), flavonoids (naringenin), alkaloids (capsaicin andpiperine), fatty acids (arachidonic, oleic and linoleic acid), monoterpenes (myrcene) and finallyphenols (tyrosol). In the recent years they are considered to be of great importance for the foodindustry, in terms of the food quality, nutrition and human health.Initially, the structure of the examined inclusion complexes was determined by X-ray crystallography.The crystal structures revealed valuable information about the guest:host stoichiometry, thegeometrical details of the host-guest conformation and complexation, and the intra- andintermolecular interactions. However, as it is known, the crystal structures are significantly affectedby crystal contacts and constitute averages of subsets of possible guest binding modes. In order toovercome these shortcomings, Molecular Dynamics studies (MDs) in aqueous environment were alsoconducted. The initial models for the MD simulations were based on the crystallographicallydetermined structures. By monitoring the obtained frames during the time frame of the simulations,the dynamical behavior and the stability of the inclusion complexes in aqueous environment wasexamined. Moreover thermodynamic parameters such as the free energy of the binding of the guest to11host (ΔGGB) decomposed into both entropic (ΔS) and enthalpic terms (ΔΗ), were calculated by theMM/GBSA method.Finally, phase solubility studies of piperine in the presence of three different hosts at 25 °C (β-CD,Randomly Methylated-β-CD and 2-HydroxyPropyl-β-CD) were conducted, in order to estimate byusing the Higuchi-Connors method, the inclusion complex type, the stability constant Ks and theComplexation Efficiency (CE), of these inclusion complexes. On the other hand, the solubility ofmyrcene in aqeous solutions of increased β-CD concentrations at 25, 35 and 45 °C was examined andthe thermodynamic parameters (ΔG, ΔH and ΔS) of the myrcene/β-CD complex were calculated froma Van`t Hoff plot (lnKc vs 1/T). The above experimental results are in agreement with the theoreticalstudies (MD simulations and MM/GBSA calculations) indicating that RM-β-CD is the best hostmolecule for piperine and the optimum temperature for the myrcene complexation with β-CD is 25°C.

Οι κυκλοδεξτρίνες (CDs) είναι κυκλικοί ολιγοσακχαρίτες που αποτελούνται από μονάδες d-γλυκοπυρανόζης συνδεδεμένες μεταξύ τους με α-(1→4) γλυκοζιτικούς δεσμούς σε έναν κυκλικόσχηματισμό. Έτσι, τα μόρια της κυκλοδεξτρίνης αποκτούν τελικά ένα σχήμα κόλουρου κώνου με τηνμεν εξωτερική περιφέρεια να χαρακτηρίζεται ως υδρόφιλη και την δε εσωτερική κοιλότηταυδρόφοβη. Αυτή η χαρακτηριστική διττή ιδιότητα των κυκλοδεξτρινών τις καθιστά ιδανικά μόρια γιατον εγκλεισμό, εντός της υδρόφοβης κοιλότητάς τους, υδρόφοβων μορίων κατάλληλου σχήματος καιμεγέθους, προς σχηματισμό υδατοδιαλυτών προϊόντων εγκλεισμού. Σε αυτές τις περιπτώσεις, τομόριο της κυκλοδεξτρίνης χαρακτηρίζεται ως «ξενιστής» (host) ενώ το εγκλεισμένο μόριο ως«ξενιζόμενο» (guest).Η πιο κοινή κυκλοδεξτρίνη που χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλές βιομηχανίες (τρόφιμα, φάρμακα,καλλυντικά κ.α.) είναι η φυσική β-κυκλοδεξτρίνη (β-CD) που αποτελείται από επτά μονάδεςγλυκόπυρανόζης, καθώς και οι παράγωγες DM-β-CD [επτάκις(2,6-δι-O-μεθυλ)-β-κυκλοδεξτρίνη] καιTM-β-CD [επτάκις (2,3,6-τρι-O-μεθυλ)-β-κυκλοδεξτρίνη) που προκύπτουν με τη μεθυλίωση τωνπρωτοταγών και δευτεροταγών υδροξυλίων της φυσικής β-CD.Στην παρούσα διατριβή, μελετώνται με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ τα παρακάτω προϊόνταεγκλεισμού: Χοληστερόλη/β-CD, Ναριγγενίνη/DM-β-CD, Ναριγγενίνη/TM-β-CD, Καψαϊκίνη/β-CD,Καψαϊκίνη/DM-β-CD, Πιπερίνη/β-CD, Πιπερίνη/DM-β-CD, Πιπερίνη/TM-β-CD, Αραχιδονικό/TM-β-CD, Ελαϊκό/β-CD, Λινελαϊκό/β-CD, Μυρκένιο/β-CD και Τυροσόλη/DM-β-CD. Τα τελευταίαχρόνια τα παραπάνω εγκλειόμενα μόρια παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον στη βιομηχανίατροφίμων, καθώς οι ιδιότητές τους επηρεάζουν την ποιότητα των τροφίμων, τη διατροφή και τηνυγεία του ανθρώπου. Αντιπροσωπεύουν ένα ευρύ φάσμα κατηγοριών χημικών ενώσεων, όπωςστεροειδή (χοληστερόλη), φλαβονοειδή (ναριγγενίνη), αλκαλοειδή (καψαϊκίνη και πιπερίνη), λιπαράοξέα (αραχιδονικό, ελαϊκό και λινελαϊκό οξύ), μονοτερπένια (μυρκένιο) και φαινόλες (τυροσόλη).Το πρώτο στάδιο του πειραματικού μέρους αφορά στην κρυσταλλογραφική μελέτη των παραπάνωσυμπλόκων. Στα στάδια της συγκεκριμένης μελέτης συμπεριλαμβάνονται η κρυστάλλωση τωνπροϊόντων εγκλεισμού, η συλλογή δεδομένων περίθλασης στο περιθλασίμετρο του εργαστηρίουΦυσικής του ΓΠΑ (λ = 1,54 Å) σε κρυογονικές συνθήκες, η επεξεργασία των δεδομένων, η επίλυσηκαι η βελτιστοποίηση των τελικών τρισδιάστατων δομών. Η παραπάνω μελέτη παρείχε σημαντικέςπληροφορίες για τη στοιχειομετρία των συμπλόκων στην κρυσταλλική κατάσταση, τη συμμετρία τωνκρυστάλλων, τον τρόπο εγκλεισμού, τις διαμοριακές αλληλεπιδράσεις κ.α. Οι συνολικά δεκατρείςκρυσταλλικές δομές καθορίστηκαν και καταχωρήθηκαν στη βάση δεδομένων Cambridge StructuralDatabase (CSD).9Κατόπιν, με βάση τις τελικές κρυσταλλικές δομές πραγματοποιήθηκαν μελέτες προσομοιώσεωνΜοριακής Δυναμικής (Molecular Dynamics) σε υδατικό περιβάλλον. Οι μελέτες αυτές επιτρέπουντην εκτίμηση της κίνησης των ατόμων και της μετατόπισης των μορίων συναρτήσει του χρόνου.Έτσι, παρέχονται επιπρόσθετες δομικές πληροφορίες για την ευστάθεια των συμπλόκων σε υδατικόδιάλυμα και τη δυναμική συμπεριφορά των επί μέρους μορίων στα υπό εξέταση συστήματα.Επιπλέον, με την εφαρμογή της μεθόδου MM/GBSA έγινε εκτίμηση των θερμοδυναμικώνπαραμέτρων που σχετίζονται με τη σταθερότητα των προϊόντων εγκλεισμού κατά τη διάρκεια τηςπροσομοίωσης, όπως η μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας πρόσδεσης (ΔGGB) η ενθαλπία (ΔΗ) και ηεντροπία (ΔS) του συστήματος.Τέλος, πραγματοποιήθηκαν και φασματομετρικές μελέτες σε ορισμένα προϊόντα εγκλεισμούπροκειμένου να μελετηθεί η αύξηση της υδατοδιαλυτότητας των ξενιζομένων μορίων (μελέτεςΔιαγραμμάτων Διαλυτότητας - Phase Solubility studies). Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η αύξησητης υδατοδιαλυτότητας της πιπερίνης παρουσία διαφορετικών ξενιστών (β-CD, τυχαία μεθυλιωμένηβ-CD και 2-υδροξυπρόπυλ-β-CD) στους 25 C και του μυρκενίου παρουσία φυσικής β-CD σε τρειςδιαφορετικές θερμοκρασίες (25, 35 και 45 C). Οι συγκεκριμένες μελέτες επέτρεψαν την εκτίμησητης σταθεράς σύνδεσης Kc και της απόδοσης συμπλοκοποίησης CE (complexation efficiency) ολικάστο διάλυμα, σύμφωνα με τη μέθοδο των Higuchi-Connors. Ειδικά για το μυρκένιο, ηπραγματοποίηση των πειραμάτων σε τρεις θερμοκρασίες κατέστησε εφικτό τον συσχετισμό τουφυσικού λογαρίθμου της Kc (lnKc) με τον αντίστροφο λόγο της θερμοκρασίας (1/Τ) και τονσχεδιασμό γραφήματος Van’t Hoff (Van`t Hoff plot), από το οποίο έγινε δυνατός ο υπολογισμός τωνθερμοδυναμικών παραμέτρων του συμπλόκου μυρκενίου/β-CD (ΔG, ΔH και ΔS). Τα αποτελέσματατων υπολογιστικών (MDs) και πειραματικών μεθόδων βρίσκονται σε σχετική συμφωνία,υποδεικνύοντας για την περίπτωση της πιπερίνης ως καταλληλότερο ξενιστή την RM-β-CD, ενώ γιατο σύμπλοκο εγκλεισμού του μυρκενίου σε β-CD τους 25C ως καταλληλότερη θερμοκρασίασυμπλοκοποίησης .