Computational design for drugging protein membrane interfaces

Abstract

Abnormal protein-membrane attachment is involved in deregulated cellular pathways and in disease. Therefore, the possibility to modulate protein-membrane interactions represents a new promising therapeutic strategy for peripheral membrane proteins that have been considered so far undruggable. Currently, the lack of a suitable theoretical background, experimental data, and simulation technology capable to implement this drug design strategy leads to high development costs of small molecules targeting this interface. The aim of this dissertation is to implement a novel drug design workflow for targeting protein-membrane interfaces by developing new algorithms used complementary to existing methods using the following steps: 1. Development of a fast and efficient algorithm predicting the protein-membrane interfaces of peripheral membrane proteins using machine learning. 2. Development of a drug design workflow for targeting the protein-membrane interfaces and implementing it in a web-server. 3. Identification of allosteric networks connecting membrane-binding domains using existing methodologies using PI3Kα and K-Ras4B as test cases. 4. Development of a new algorithm for the prediction of allosteric networks using deep learning. To design a new algorithm for the prediction of the protein-membrane interfaces using machine learning (step 1), first a dataset of peripheral membrane proteins with experimentally known membrane-penetrating amino acids was assembled. Physicochemical features related to the penetration of amino acids into the membrane were used to train 21 different classifiers and voting classifiers. Evaluation of the ensemble classifier accuracy produced a macro-averaged F1 score = 0.92 and an MCC = 0.84 for predicting correctly membrane-penetrating amino acids on unknown proteins of a validation set. Predictions were further verified in independent test sets. The python code is available at https://github.com/zoecournia/DREAMM. This algorithm was integrated into our workflow for determining binding sites in the predicted protein-membrane interfaces (step 2). In this workflow, small molecule binding sites in multiple protein structural conformations are identified and, only the sites located adjacent to the predicted membrane-penetrating amino acids are selected. The workflow was integrated into a web-server, which was onboarded in the European Open Science Cloud at https://dreamm.ni4os.eu/. In order for the identified binding sites to be functional, they need to communicate with the active site of the protein through allosteric networks. We thus applied existing allosteric network prediction methodologies for the study of two membrane oncoproteins PI3Kα and K-Ras4B as test cases (step 3). Finally, we aimed at creating a novel tool for predicting and evaluating the allosteric cross-linking of protein amino acids (step 4). To this end, we trained Graph Neural Networks (GNNs) in molecular dynamics simulations of 147 proteins. Structural and evolutionary-based characteristics were calculated, and GNNs were trained with the aim of predicting the allosteric cross-linking of amino acids. This tool is expected to predict allosteric networks in novel proteins without the need of molecular dynamics simulations.

Η μη φυσιολογική σύνδεση πρωτεΐνης-μεμβράνης εμπλέκεται σε απορυθμισμένα σηματοδοτικά μονοπάτια και σε ασθένειες. Ως εκ τούτου, η δυνατότητα ρύθμισης των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-μεμβράνης αποτελεί μια νέα υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για περιφερικές μεμβρανικές πρωτεΐνες που θεωρούνται φαρμακολογικά δυσπρόσιτες. Η έλλειψη κατάλληλου θεωρητικού υποβάθρου, πειραματικών δεδομένων και τεχνικών προσομοίωσης ικανών να εφαρμόσουν αυτήν τη στρατηγική σχεδιασμού φαρμάκων οδηγεί σε υψηλό κόστος ανάπτυξης μικρών μορίων που στοχεύουν αυτή τη διεπιφάνεια. Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η δημιουργία μιας καινοτόμου ροής εργασίας σχεδιασμού φαρμάκων για τη στόχευση της διεπιφάνειας πρωτεΐνης-μεμβράνης, αναπτύσσοντας νέους αλγορίθμους που χρησιμοποιούνται συμπληρωματικά με τις υπάρχουσες μεθόδους χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα βήματα: 1. Ανάπτυξη ενός γρήγορου και αποτελεσματικού αλγορίθμου που προβλέπει τις διεπιφάνειες πρωτεΐνης-μεμβράνης των περιφερειακών μεμβρανικών πρωτεϊνών με χρήση μηχανικής μάθησης. 2. Ανάπτυξη μιας ροής εργασίας σχεδιασμού φαρμάκων για τη στόχευση των διεπιφανειών πρωτεΐνης-μεμβράνης και υλοποίησή της σε διαδικτυακή πλατφόρμα. 3. Προσδιορισμός αλλοστερικών δικτύων που συνδέουν τις περιοχές δέσμευσης στη μεμβράνη εφαρμόζοντας υπάρχουσες μεθοδολογίες χρησιμοποιώντας τις ογκοπρωτεΐνες PI3Kα και K-Ras4B ως περιπτωσιολογικές μελέτες. 4. Ανάπτυξη νέου αλγορίθμου για την πρόβλεψη αλλοστερικών δικτύων με χρήση βαθιάς μάθησης. Για να σχεδιάσουμε έναν νέο αλγόριθμο για την πρόβλεψη της διεπιφάνειας πρωτεΐνης-μεμβράνης (βήμα 1), συγκεντρώσαμε μία βάση δεδομένων αποτελούμενη από περιφερικές μεμβρανικές πρωτεΐνες με πειραματικά γνωστά αμινοξέα που διεισδύουν στη μεμβράνη. Τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με τη διείσδυση αμινοξέων στη μεμβράνη χρησιμοποιήθηκαν για την εκπαίδευση 21 διαφορετικών ταξινομητών και μετα-ταξινομητών. Η αξιολόγηση της ακρίβειας του τελικού ταξινομητή παρουσίασε βαθμολογία F1 = 0,92 και MCC = 0,84 για την σωστή πρόβλεψη αμινοξέων που διεισδύουν στη μεμβράνη σε άγνωστες πρωτεΐνες ενός συνόλου επικύρωσης. Οι προβλέψεις επαληθεύτηκαν περαιτέρω σε ανεξάρτητα σύνολα δοκιμών. Ο κώδικας είναι διαθέσιμος στη διεύθυνση https://github.com/zoecournia/DREAMM. Αυτός ο αλγόριθμος ενσωματώθηκε στη ροή εργασίας μας για τον προσδιορισμό των κοιλοτήτων πρόσδεσης στη διεπιφάνεια πρωτεΐνης-μεμβράνης (βήμα 2). Σε αυτή τη ροή εργασίας, αναγνωρίζονται κοιλότητες πρόσδεσης μικρών μορίων σε πολλαπλές δομικές διαμορφώσεις πρωτεϊνών και επιλέγονται μόνο οι θέσεις που βρίσκονται δίπλα στα αμινοξέα που διεισδύουν στη μεμβράνη. Η ροή εργασίας ενσωματώθηκε σε διαδικτυακή πλατφόρμα, η οποία εντάχθηκε στο European Open Science Cloud στη διεύθυνση https://dreamm.ni4os.eu/. Προκειμένου οι εντοπισμένες κοιλότητες πρόσδεσης να είναι λειτουργικές, πρέπει να επικοινωνούν με τo ενεργό κέντρο της πρωτεΐνης μέσω αλλοστερικών δικτύων. Γι’ αυτό, εφαρμόσαμε υπάρχουσες μεθοδολογίες πρόβλεψης αλλοστερικών δικτύων για τη μελέτη δύο μεμβρανικών ογκοπρωτεϊνών, PI3Kα και K-Ras4B, ως περιπτωσιολογικές μελέτες (βήμα 3). Τέλος, στοχεύσαμε στη δημιουργία ενός νέου εργαλείου για την πρόβλεψη και την αξιολόγηση της αλλοστερικής διασύνδεσης των αμινοξέων (βήμα 4). Για το σκοπό αυτό, εκπαιδεύσαμε νευρωνικά δίκτυα γράφων (GNNs) σε προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής 147 πρωτεϊνών. Υπολογίστηκαν δομικά και εξελικτικά χαρακτηριστικά και εκπαιδεύτηκαν GNNs με στόχο την πρόβλεψη της αλλοστερικής διασύνδεσης των αμινοξέων. Αυτό το εργαλείο αναμένεται να προβλέπει τα αλλοστερικά δίκτυα σε νέες πρωτεΐνες χωρίς την ανάγκη προσομοιώσεων μοριακής δυναμικής.