Μελέτη του ρόλου της ενζυμικής πρωτεΐνης IRE1 στον καρκίνο με μεθόδους βιοπληροφορικής ανάλυσης

Abstract

Proteostasis imbalance is emerging as a major hallmark of cancer, driving tumor aggressiveness. Evidence suggests that the endoplasmic reticulum (ER), a major site for protein folding and quality control, plays a critical role in cancer development. This concept is valid in glioblastoma multiform (GBM), the most lethal primary brain cancer with no effective treatment. Previous studies demonstrated that the ER stress sensor IRE1α (also referred to as IRE1) contributes to GBM progression, through XBP1 mRNA splicing and regulated IRE1-dependent decay (RIDD) of RNA. Here, we first demonstrated IRE1 signaling significance to human GBM and defined specific IRE1-dependent gene expression signature of two main components with 19 genes each, reflecting the XBP1s and RIDD signaling activity, respectively, that were confronted to human GBM transcriptomes. The activity assessment of both signaling axes and their correlation with biochemical, clinical, immunological and phenotype characteristics allowed us to demonstrate the antagonistic roles of XBP1 mRNA splicing and RIDD on tumor outcomes, mainly through selective remodeling of the tumor stroma. Moreover, we mapped the miRNA network involved in the regulation of the two signaling axes for the first time and identified 11 candidate miRNAs that control IRE1 signaling activity in both GBM and Triple-Negative Breast Cancer (TNBC) by controlling biological processes involved in the infiltration/invasion, migration and metastasis of tumor cells and the cancer stem cell reprogramming as well. Next, we deciphered the nucleotide sequence and RNA secondary structure motifs of RIDD targets and we constructed in silico two scaffold RNA sequences (probes) folding in stem-loop and internal loop, respectively, after the encapsulation of identified IRE1 cleavage site motifs in the loops’ region. Based on the RNA probes constructed in silico, RNA oligos were synthesized biochemically, and were validated as RIDD targets by an IRE1-mediated cleavage assay. In parallel, we developed a bioinformatics methodology for the identification of cleavage site motifs in the sequences of hairpin and internal loops in the precursor miRNAs of human miRBase, highlighting candidate miRIDD targets as well. The findings of RNA motif sequence and structure analysis helped us to develop a new methodology for the identification and quantification of cleavage site motifs in RNAseq data. Moreover, the computational methodologies that were utilized throughout the GBM for the evaluation of IRE1 activity was applied to other 11 solid tumors of Cancer Genome Atlas (TCGA) and their patients were grouped into high and low IRE1/XBP1s/RIDD molecular subtypes with a direct impact on patient survival rates, while significant correlation was demonstrated with specific molecular, clinical and immunological markers. This study provides the first demonstration of a dual role of IRE1 downstream signaling in cancer and opens a new therapeutic window to abrogate tumor progression. The IRE1α-centric landscape of tumor microenvironment is summarized in the “Synopsis” figure which highlights the pivotal role of IRE1 protein in cancer. Finally, for the sake of translational research and precision medicine we developed a GUI (graphical user interface) R Shiny platform that allows users to i) retrieve molecular and clinical TCGA data, ii) process and filter molecular data by increasing the ratio between signal to noise, iii) analyze and integrate NGS data from different platforms by using cross-platform harmonization, iv) derive gene signatures with potential biomarkers that characterize the phenotype under study, v) perform differential expression analysis and functional enrichment analysis, vi) stratify cancer patients based on the gene signature expression profile and vii) visualize their results with a series of sophisticated ways including hierarchical clustering heatmaps, PCA plots, survival plots, oncoplots, Volcano plots and gene network representations.

Η διαταραχή της πρωτεόστασης έχει αναδειχθεί ως κύριο χαρακτηριστικό του καρκίνου, προσδιορίζοντας την επιθετικότητα των όγκων. Υπάρχουν σημαντικές ενδείξεις ότι το Ενδοπλασματικό Δίκτυο (Ε.Δ.), το κύριο κυτταρικό διαμέρισμα για την αναδίπλωση των πρωτεϊνών και τον έλεγχο ποιότητας, διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου. Η διαπίστωση αυτή ισχύει σε σημαντικό βαθμό και για το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM), τον πιο θανατηφόρο πρωτοπαθή καρκίνο του εγκεφάλου χωρίς αποτελεσματική θεραπεία. Προηγούμενες μελέτες είχαν δείξει ότι ο αισθητήρας στρες Ε.Δ. IRE1α (αναφέρεται και ως IRE1) συμβάλλει στην εξέλιξη του GBM, μέσω του μη συμβατικού ματίσματος του mRNA του XBP1 και της εξαρτώμενης από την IRE1 αποικοδόμησης (RIDD) του RNA. Εδώ, αποδεικνύουμε για πρώτη φορά την σημασία της IRE1 σηματοδότησης στην ανάπτυξη και εξέλιξη του ανθρώπινου GBM και εξάγουμε συγκεκριμένη γονιδιακή υπογραφή (IRE1sign38) που αποτελείται από δύο συνιστώσες 19 γονιδίων η κάθε μια, αντιπροσωπεύοντας την XBP1s και RIDD σηματοδοτική ενεργότητα, αντίστοιχα, με άμεση εφαρμογή σε ανθρώπινα μεταγραφικά GBM δεδομένα. Η αξιολόγηση της δραστικότητας των δύο κύριων σηματοδοτικών αξόνων και η συσχέτισή τoυς με βιοχημικά, κλινικά, ανοσολογικά και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά μας επέτρεψε να αναδείξουμε τον ανταγωνιστικό τους ρόλο στην αύξηση και εξέλιξη του όγκου, κυρίως μέσω επιλεκτικής αναδιαμόρφωσης του στρώματος του. Επιπλέον, χαρτογραφήσαμε για πρώτη φορά το δίκτυο των miRNAs που εμπλέκεται στην ρύθμιση των δύο σηματοδοτικών αξόνων και ταυτοποιήσαμε 11 υποψήφια miRNAs που ελέγχουν την IRE1 σηματοδοτική ενεργότητα τόσο στο GBM όσο και στον Τριπλά Αρνητικό Καρκίνο του Μαστού (TNBC), ρυθμίζοντας λειτουργίες που καθορίζουν την κυτταρική διήθηση/εισβολή, μετανάστευση και μεταστατικότητα των καρκινικών κυττάρων αλλά και τον επαναπρογραμματισμό τους σε βλαστικά κύτταρα. Στη συνέχεια, αποκρυπτογραφήσαμε τα νουκλεοτιδικά και δομικά μοτίβα 2ταγούς RNA δομής που χαρακτηρίζουν τους RIDD στόχους και κατασκευάσαμε in silico δύο πρότυπες RNA ακολουθίες που αναδιπλώνονταν σε δομή στελέχους-βρόχου και εσωτερικού βρόχου, αντίστοιχα, κατόπιν ενσωμάτωσης των ταυτοποιημένων νουκλεοτιδικών μοτίβων αποκοπής από την IRE1 στην περιοχή των βρόχων. Με βάση τις πρότυπες RNA ακολουθίες συντέθηκαν ολιγονουκλεοτίδια RNA – πιθανοί RIDD στόχοι, οι οποίοι επιβεβαιώθηκαν με in vitro πειράματα αποκοπής. Παράλληλα, αναπτύξαμε μια μεθοδολογία βιοπληροφορικής για την ταυτοποίηση υποψήφιων νουκλεοτιδικών μοτίβων αποκοπής από την IRE1 σε περιοχές βρόχων φουρκέτας και εσωτερικών βρόχων εξετάζοντας το σύνολο των ανθρώπινων πρόδρομων miRNA μορίων της βάσης miRBase, αναδεικνύοντας υποψήφιους RIDD miRNA (ή miRIDD) στόχους. Επίσης, με βάση την ανάλυση των RNA ακολουθιών αναπτύξαμε μεθοδολογία για τον εντοπισμό και την ποσοτική εκτίμηση των μοτίβων αποκοπής σε RNAseq δεδομένα. Επιπρόσθετα, η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε για την εκτίμηση της IRE1 ενεργότητας στο GBM, εφαρμόστηκε σε 11 ακόμη συμπαγείς όγκους του TCGA προγράμματος και οι ασθενείς ομαδοποιήθηκαν σε υπότυπους υψηλής και χαμηλής IRE1/XBP1s/RIDD σηματοδοτικής ενεργότητας με άμεση συσχέτιση με μοριακούς, κλινικούς και ανοσολογικούς δείκτες αλλά και με σημαντικό αντίκτυπο στα ποσοστά επιβίωσης των ασθενών. Αυτή η μελέτη παρέχει την πρώτη απόδειξη ενός διπλού ρόλου της IRE1 σηματοδότησης στον καρκίνο και ανοίγει ένα νέο θεραπευτικό παράθυρο για τηνπαρεμπόδιση της εξέλιξης της νόσου. Τέλος, στο πλαίσιο της μεταφραστικής έρευνας και της ιατρικής ακριβείας αναπτύξαμε μια φιλική προς τον χρήστη (σε γραφικό περιβάλλον) R Shiny υπολογιστική πλατφόρμα που επιτρέπει 1) την ανάκτηση μοριακών και κλινικών δεδομένων του προγράμματος TCGA, 2) την επεξεργασία και το φιλτράρισμα των μοριακών δεδομένων μέσω τεχνικών που αυξάνουν το βιολογικό σήμα έναντι του θορύβου, 3) την ανάλυση και ενσωμάτωση γονιδιωματικών δεδομένων μεγάλης κλίμακας από διαφορετικές πλατφόρμες μέσω τεχνικών ομαλοποίησης, 4) την εξαγωγή γονιδιακών υπογραφών σημαντικών βιοδεικτών που χαρακτηρίζουν τον εξεταζόμενο φαινότυπο, 5) την ανάλυση διαφορικής έκφρασης και την λειτουργική ανάλυση εμπλουτισμού σε λίστες γονιδίων, 6) τον χαρακτηρισμό των ασθενών μιας κοόρτης με βάση το πρότυπο έκφρασης της γονιδιακής υπογραφής αλλά και την 7) οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων με μια σειρά εκλεπτυσμένων μεθόδων απεικόνισης που περιλαμβάνουν μεταξύ άλλων τους χάρτες θερμικής έντασης με την ιεραρχική ομαδοποίηση ασθενών και γενετικών οντοτήτων, τα διαγράμματα ανάλυσης κύριων συνιστωσών, τις καμπύλες ολικής επιβίωσης, τα διαγράμματα oncoplot, τα διαγράμματα Volcano και τις αναπαραστάσεις δικτύων γονιδιακών αλληλεπιδράσεων.