Διερεύνηση της παρουσίας δυνητικά τοξικών κυανοβακτηρίων και της βιοτοξίνης, Mικροκυστίνη LR, σε θαλάσσια ύδατα και σε μύδια εντατικών καλλιεργειών του Θερμαϊκού κόλπου

Abstract

Cyanobacteria are prokaryotic, photosynthetic, Gram negative microorganisms. They are unicellular, filamentous, solitary or in colonies. They are distributed worldwide in marine, brackish and internal waters. They can also survive in extreme environments. They often appear in eutrophic ecosystems, where their population can rise under suitable climate conditions, causing the “water bloom” phenomenon.During the “water bloom” phenomenon, potentially toxic species produce secondary metabolites, the cyanotoxins. Microcystins are the most common cyanotoxins. They are cyclic heptapeptides and they have hepatotoxic action. The analogue, microcystin-LR, has been classified as potentially human carcinogen (group 2B) by the International Agency for Research on Cancer (IARC). Potentially toxic species of cyanobacteria and microcystin -LR, have been detected in Greek internal waters, mostly in eutrophic lakes during the warm periods. The data are poor in marine environments. There is only one report in sea waters and Mediterranean mussels Mytilus galloprovincialis, in Amvrakikos gulf. There are no data regarding Thermaikos gulf, which is a semi-closed, eutrophic gulf in northern Greece, where the 85%-90% of the national mussel farming of Mytilus galloprovincialis is located.The objectives of the thesis were:i) The detection of potentially toxic species of cyanobacteria in marine and brackish waters of Thermaikos gulf.ii) The detection of potentially toxic species of cyanobacteria in farmed mussels in Thermaikos gulf.iii) The isolation and identification of the strains.iv) The detection of microcystins in marine and brackish waters of Thermaikos gulf (screening) and the detection of microcystins -RR, -LR and -YR in farmed mussels.v) The experimental contamination of farmed mussels, with a potential toxic specie, isolated from Thermaikos gulf and the detection of microcystins production related to the abundance.The research was conducted in four parts:i) Epidemiological survey of the presence of potentially toxic species of cyanobacteria in marine and brackish waters of Thermaikos gulf and in farmed mussels.ii) Epidemiological survey of the presence of microcystins in marine and brackish waters of Thermaikos gulf (screening).iii) Epidemiological survey of microcystins -RR -LR and -YR in farmed mussels.iv) Experimental contamination of farmed mussels, with a potential toxic specie, isolated from Thermaikos gulf and detection of microcystins production related to the abundance.The isolation of cyanobacteria was obtained after water filtration, in Marine agar medium, supplemented with the broad spectrum antibiotics, imipenem and kanamycin and an antifungal, nystatin, at the final concentration of 50 mg/L.Water samples were filtered and extracted with methanol 75%, for microcystin detection. The same solvent was used for mussel’s extraction. The clean- up of the mussels’ samples was obtained by Solid Phase Extraction (SPE), the samples were dried, and the residue was reconstructed and examined (screening) with a commercial immunoassay method for microcystins (Adda specific) ELISA kit [(ADDA)-DM (direct monoclonal)]. Mussel samples with concentration upper than 1ppb, were confirmed by Ultra High Performance Liquid Chromatography coupled with a high- resolution mass spectrometer (HRMS) (Orbitrap analyzer).The experimental contamination of the farmed mussels Mytilus galloprovincialis, was performed by feeding them for three days with two different populations (104 cells/mL and 105 cells/mL) of the nanoplanktonic potential toxic cyanobacterium, Synechocystis sp., cultured in MA broth. Samples were taken in 24, 48 and 72 hours after contamination for the detection of microcystins as above.The epidemiological survey showed that the potentially toxic species Synechocystis sp., Synechococcus sp., Anabaena sp and Anabaena flos-aque were found in marine, and brackish waters. Microcystins were detected at low concentrations. Spatial and temporal distribution during Spring and Autumn was observed. Regarding the physicochemical parameters, temperature seemed to be the most effective in cyanobacterial growth. Statistically significant differences were observed among the sampling areas according to the season, which was explained by the location of the sampling areas, the gulf stream circulation and the annual runoff of the adjacent large rivers.Microcystin -RR and traces of microcystin -LR were detected in mussels. Microcystin -ΥR was not detected. The most common microcystin was microcystin-RR. A seasonal distribution was evident. Also, bioaccumulation in digestive gland was observed. In a case, during an expansion of bloom near the Delta of Axios River to the coastal zone, the concentration in farmed mussels in the area was above the Tolerable Daily Intake (TDI), as it is set by the World Health Organization (0.04 μg/KG B.W./d for healthy adults).Regarding the experimental contamination, it was found that microcystins were produced after 72 hours of exposure at the abundance of 105 cells/mL of the cyanobacterium Synechocystis sp.. Only microcystin -RR and traces of microcystin -LR were detected.It was concluded:1. Potentially toxic cyanobacteria were isolated in Thermaikos gulf, using Marine agar supplemented with imipenem, kanamycin and nystatin at the final concentration of 50 mg/L. Temporal and spatial distribution was observed, especially during spring and autumn.2. The marine biotoxins microcystin -RR and traces of microcystin – LR were detected in waters and in mussels Mytilus galloprovincialis.3. Climate conditions, the physicochemical parameters, the annual run-off of the adjacent rivers and the enrichment of the gulf affected the presence of the cyanobacteria.4. During a water bloom phenomenon at the estuaries of Axios river, an expansion was observed at the coastal zones. Microcystins were detected in farmed mussels Mytilus galloprovincialis.5. Bioaccumulation of microcystins was observed in the digestive gland while traces only were detected in the muscles.6. An overestimation was observed during the analysis by ELISA, in relation with LC-Orbitrap HRMS.7. The experimental exposure of farmed mussels Mytilus galloprovincialis to the potentially toxic Synechocystis sp., revealed the production of microcystins after 72 hours at the abundance of 105 cells/mL.Proposals in the aim of the reduction of the “water bloom” phenomenon and the protection of Public Health, were given.

Τα κυανοβακτήρια είναι προκαρυωτικοί, φωτοσυνθετικοί, Gram αρνητικοί μικροοργανισμοί. Εμφανίζονται ως μονοκύτταρες ή νηματοειδείς μορφές απλές ή διακλαδισμένες, μονήρη ή σε αποικίες. Η διασπορά τους είναι παγκόσμια και απαντώνται σε θαλάσσια, υφάλμυρα και εσωτερικά ύδατα. Έχουν την ικανότητα να επιβιώνουν σε εξαιρετικά δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες. Η παρουσία τους είναι συχνή σε ευτροφικά υδάτινα οικοσυστήματα, όπου ο πληθυσμός τους δύναται στις κατάλληλες κλιματολογικές και περιβαλλοντικές συνθήκες να αυξηθεί υπέρμετρα, προκαλώντας το φαινόμενο της «άνθησης του νερού» (water bloom).Τα δυνητικά τοξικά στελέχη των κυανοβακτηρίων παράγουν δευτερογενείς μεταβολίτες, τις κυανοτοξίνες. Οι πιο διαδομένες παγκοσμίως είναι οι μικροκυστίνες (MCs), οι οποίες αποτελούν μεγαλομοριακά κυκλικά επταπεπτίδια με ηπατοτοξική δράση. Από τις μικροκυστίνες η μικροκυστίνη -LR έχει ταξινομηθεί από τον Διεθνή Οργανισμό Ερευνών για τον Καρκίνο (International Agency for Research on Cancer, IARC) στην ομάδα 2Β, ως δυνητικό καρκινογόνο για τον άνθρωπο. Στην Ελλάδα η παρουσία των δυνητικά τοξικών στελεχών κυανοβακτηρίων και μικροκυστινών έχει αναφερθεί κυρίως σε εσωτερικά ύδατα. Σε θαλάσσια ύδατα η βιβλιογραφία είναι περιορισμένη. Υπάρχει μόνο μία αναφορά στα ύδατα του Αμβρακικού κόλπου και σε μύδια Μεσογείου του είδους Mytilus galloprovincialis. Δεν υπάρχει καμία αναφορά για τον Θερμαϊκό κόλπο στη βόρεια Ελλάδα, στον οποίο ενεργοποιείται επαγγελματικά το μεγαλύτερο ποσοστό μυδοκαλλιεργητών (85%-90%).Λόγω των ανωτέρω και δεδομένου ότι ο Θερμαϊκός είναι ένας ευτροφικός κόλπος, δημιουργούνται ερωτήματα σχετικά με την παρουσία δυνητικά τοξικών στελεχών κυανοβακτηρίων και την πιθανή παραγωγή μικροκυστινών από αυτά. Σκοπός της παρούσας μελέτης για την απάντηση των ανωτέρω προβληματισμών ήταν:1. Η διερεύνηση της παρουσίας τοξικών κυανοβακτηρίων στα θαλάσσια ύδατα του καλλιεργητικού πάρκου του Θερμαϊκού κόλπου και σε παρακείμενα υφάλμυρα ύδατα.2. Η διερεύνηση της παρουσίας τοξικών κυανοβακτηρίων σε μύδια από μυδοκαλλιέργειες του καλλιεργητικού πάρκου του Θερμαϊκού κόλπου.3. Η απομόνωση και ταυτοποίηση των στελεχών δυνητικά τοξικών κυανοβακτηρίων.4. Η ανίχνευση προσχηματισμένης τοξίνης από θαλάσσια και υφάλμυρα ύδατα και η ανίχνευση των συχνότερων μικροκυστινών -LR, -RR και -YR από μύδια μυδοκαλλιεργειών του Θερμαϊκού κόλπου.5. Η διενέργεια πειραματικής μόλυνσης μυδιών με καθορισμένους πληθυσμούς θαλάσσιου στελέχους του Θερμαϊκού κόλπου και η ανίχνευση σε αυτά μικροκυστινών.Η έρευνα χωρίστηκε σε τέσσερις ενότητες:i) Στην πρώτη έγινε επιδημιολογική διερεύνηση της παρουσίας δυνητικά τοξικών κυανοβακτηρίων σε θαλάσσια και υφάλμυρα ύδατα και σε μύδια καλλιέργειας στον Θερμαϊκό κόλπο.ii) Στη δεύτερη έγινε επιδημιολογική διερεύνηση της παρουσίας μικροκυστινών σε θαλάσσια και υφάλμυρα ύδατα του Θερμαϊκού κόλπου.iii) Στην τρίτη έγινε επιδημιολογική διερεύνηση της παρουσίας μικροκυστινών σε καλλιεργούμενα μύδια του Θερμαϊκού κόλπου.iv) Τέλος στην τέταρτη διενεργήθηκε πειραματική μόλυνση καλλιεργούμενων μυδιών του Θερμαϊκού κόλπου με δυνητικά τοξικό στέλεχος κυανοβακτηρίων που απομονώθηκε από αυτόν και ανίχνευση μικροκυστινών από διαφορετικούς πληθυσμούς.Η απομόνωση των κυανοβακτηρίων επιτεύχθηκε κατόπιν διήθησης νερού με τη χρήση του υποστρώματος Marine agar, στο οποίο μετά από δοκιμές προστέθηκαν τα αντιβιοτικά ιμιπενέμη και καναμυκίνη και το αντιμηκυτιακό νυστατίνη στην τελική συγκέντρωση των 50 mg/L. Ακολούθησε η ταυτοποίηση των απομονωθέντων στελεχών.Για την ανίχνευση των μικροκυστινών το νερό αρχικά διηθούνταν μέσω κατάλληλων ηθμών. Για τη λήψη του εκχυλίσματος χρησιμοποιήθηκε υδατικό διάλυμα μεθανόλης 75%. Το ίδιο διάλυμα χρησιμοποιήθηκε και για την λήψη εκχυλίσματος ομογενοποιημένου δείγματος μυδιών. Ο καθαρισμός (clean up) των δειγμάτων των μυδιών γινόταν με εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού (Solid Phase Extraction, SPE), ακολουθούσε συμπύκνωση μέχρι ξηρού και επανασύσταση του δείγματος. Ο πρώτος ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των μικροκυστινών των δειγμάτων νερού και μυδιών (screening) γινόταν με ενζυμικό ανοσοπροσροφητικό προσδιορισμό (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA). Η ELISA ήταν άμεση ανταγωνιστική, ειδική για τις μικροκυστίνες και νοντουλαρίνες, ικανή να ανιχνεύσει το μοναδικό αμινοξύ Adda (3-αμινο-9-μεθοξυ-2,6,8-τριμεθυλ-10-φαινυλ-4,6-διενικό οξύ), των τοξινών αυτών [(ADDA)-DM (direct monoclonal)]. Στα δείγματα των μυδιών στα οποία η συγκέντρωση ήταν άνω του 1 ppb, έγινε επιβεβαίωση με την αναλυτική τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής απόδοσης συζευγμένης με φασματομετρία μάζας υψηλής διαχωριστικής ικανότητας.Για την πειραματική μόλυνση μυδιών του είδους Mytilus galloprovincialis χρησιμοποιήθηκε το δυνητικά τοξικό θαλάσσιο στέλεχος του νανοπλαγκτονικού κυανοβακτηρίου Synechocystis sp., που απομονώθηκε από τα θαλάσσια ύδατα του Θερμαϊκού κόλπου. Αρχικά έγινε εμπλουτισμός σε εκλεκτικό θρεπτικό υπόστρωμα ΜΑ, στο οποίο είχαν προστεθεί αντιβιοτικά ως ανωτέρω και βιοτίνη σε τελική συγκέντρωση 0,1 mg/L. Κατόπιν καταμέτρησης των κυττάρων και μετά από τους απαραίτητους υπολογισμούς λάμβανε χώρα η μόλυνση των μυδιών σε δεξαμενές, όπου ενοφθαλμιζόταν καθημερινά ποσότητα θρεπτικού ζωμού με το τοξικό στέλεχος, σε πληθυσμό 104 κύτταρα/mL και 105 κύτταρα/mL τεχνητού θαλασσινού νερού. Μετά την μόλυνση λαμβάνονταν δείγματα μυδιών στις 24, 48 και 72 ώρες και ακολουθούσε η ανίχνευση μικροκυστινών ως ανωτέρω.Από τα αποτελέσματα διαπιστώθηκε πως από τα θαλάσσια ύδατα του Θερμαϊκού κόλπου, καθώς και από τα παρακείμενα υφάλμυρα απομονώθηκαν για πρώτη φορά τα δυνητικά τοξικά στελέχη Synechocystis sp, Synechococcus sp., Anabaena sp. και Anabaena flos-aque. Κατά το screening ανιχνεύτηκαν μικροκυστίνες σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Διαπιστώθηκε πως η παρουσία των στελεχών των κυανοβακτηρίων και η ανίχνευση των παραγόμενων από αυτά μικροκυστινών παρουσίαζε εποχική κατανομή, κυρίως την άνοιξη και το φθινόπωρο. Αναφορικά με την επίδραση των φυσικοχημικών παραγόντων, διαπιστώθηκε πως η θερμοκρασία επηρέαζε περισσότερο την ανάπτυξη των κυανοβακτηρίων και κατ’ επέκταση συνδέθηκε και με την ανίχνευση μικροκυστινών. Στατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν και μεταξύ των περιοχών δειγματοληψίας ανάλογα με την εποχή, γεγονός που εξηγήθηκε από τη θέση του κάθε σταθμού δειγματοληψίας, την κίνηση των ρευμάτων του κόλπου και τις απορροές των παρακείμενων μεγάλων ποταμών.Στα καλλιεργούμενα μύδια του Θερμαϊκού κόλπου ανιχνεύτηκαν η μικροκυστίνη -RR, σε ίχνη η μικροκυστίνη -LR, ενώ η μικροκυστίνη -ΥR δεν ανιχνεύτηκε. Η εποχικότητα ήταν ανάλογη της προηγούμενης Η συγκέντρωση των τοξινών σε ορισμένες περιπτώσεις ήταν υψηλότερη αυτής των νερών, γεγονός που αποδόθηκε αφενός μεν στο ότι στο νερό ανιχνεύτηκε προσχηματισμένη τοξίνη, αφετέρου δε στο ότι τα μύδια έχουν την ικανότητα της βιοσυσσώρευσης στο περιβάλλον διαβίωσής τους. Σε μία περίπτωση εξάπλωσης φαινομένου «άνθησης» από το Δέλτα του Αξιού στις παράκτιες ζώνες κοντά σε πασσαλωτές μυδοκαλλιέργειες, η συγκέντρωση των μικροκυστινών που ανιχνεύτηκαν υπερέβαινε την ανεκτή ημερήσια πρόσληψη (Tolerable Daily Intake, TDI), όπως έχει οριστεί από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (Π.Ο.Υ.), στα 0,04 μg/Kg ΣΒ για υγιείς ενηλίκους.Από την πειραματική μόλυνση των μυδιών του είδους Mytilus galloprovincialis διαπιστώθηκε πως παραγωγή μικροκυστινών είχαμε μόνο από τον πληθυσμό των 105 κύτταρων/mL του δυνητικά τοξικού κυανοβακτηρίου Synechocystis sp.. Οι μικροκυστίνες που παρήχθησαν in vitro ήταν η μικροκυστίνη -RR και σε ίχνη η μικροκυστίνη -LR. Η μέγιστη συγκέντρωση παρατηρούνταν την τρίτη μέρα της μόλυνσης. Συνεπώς προέκυψε το συμπέρασμα ότι ο ελάχιστος πληθυσμός του θαλάσσιου στελέχους Synechocystis sp. που είναι ικανός να παράγει μικροκυστίνες είναι τα 105 κύτταρα/mL, υπό τις παρούσες συνθήκες της έρευνας.Από την έρευνα προέκυψαν τα ακόλουθα συμπεράσματα:1. Από τα θαλάσσια και υφάλμυρα ύδατα του Θερμαϊκού κόλπου απομονώθηκαν δυνητικά τοξικά στελέχη κυανοβακτηρίων, με τη χρήση του υποστρώματος Marine agar, κατόπιν προσθήκης σε αυτό των αντιβιοτικών ευρέος φάσματος ιμιπενέμης και καναμυκίνης και ενός αντιμυκητιακού της νυστατίνης, στην τελική συγκέντρωσή των 50 mg/L υποστρώματος. Η δε ανίχνευσή τους παρουσίασε χωρική και χρονική κατανομή, κυρίως την άνοιξη και το φθινόπωρο.2. Ανιχνεύτηκαν μικροκυστίνες στα ύδατα, καθώς και σε καλλιεργούμενα μύδια του Θερμαϊκού κόλπου του είδους Mytilus galloprovincialis, με συχνότερες τη μικροκυστίνη -RR και σε ίχνη τη μικροκυστίνη -LR. Η ανίχνευσή τους ήταν εποχιακή, με τις μεγαλύτερες τιμές να παρατηρούνται κατά τον μήνα Μάιο.3. Οι φυσικοχημικές παράμετροι, οι κλιματολογικές συνθήκες και οι απορροές των παρακείμενων ποταμών που εκβάλουν στον Θερμαϊκό κόλπο, επηρέασαν την παρουσία δυνητικά τοξικών στελεχών, λόγω φαινομένων ευτροφισμού.4. Παρατηρήθηκε εξάπλωση φαινομένου «άνθησης» από τις εκβολές του Αξιού προς τις παράκτιες ζώνες του Θερμαϊκού κόλπου, με ανίχνευση μικροκυστινών σε μύδια παρακείμενης μυδοκαλλιέργειας.5. Στα μύδια παρατηρήθηκε βιοσυσσώρευση μικροκυστινών στο ηπατοπάγκρεας, ενώ στη σάρκα οι συγκεντρώσεις ήταν αμελητέες.6. Κατά τη σύγκριση των μεθόδων ELISA και LC-Orbitrap HRMS, διαπιστώθηκε υπερεκτίμηση των συγκεντρώσεων των μικροκυστινών κατά την ανάλυση με την ενζυμική μέθοδο.7. Κατά την πειραματική μόλυνση με το δυνητικά τοξικό γένος Synechocystis sp., που απομονώθηκε από τον Θερμαϊκό κόλπο, παρατηρήθηκε παραγωγή μικροκυστινών από πληθυσμό 105 κύτταρα/mL τεχνητού θαλασσινού νερού και βιοσυσσώρευση αυτών στα μύδια του είδους Mytilus galloprovincialis μετά από 72 ώρες έκθεσης.Έγιναν προτάσεις σχετικά με τη λήψη μέτρων αφενός μεν για τη μείωση του φαινομένου της «άνθησης του νερού» στον Θερμαϊκό κόλπο, αφετέρου δε για την προστασία της Δημόσιας Υγείας.