Vascularization of connective tissue in Organ-on-Chip

Abstract

Cultures of primary human cells provide more ethical and potentially more effective alternative to animal models for drug testing. Recent studies also evidenced that culturing together two or more cell types in a three-dimensional (3D) microenvironment that mimicries the native tissue architecture improves cell viability, polarization, and differentiation in vitro. Among all 3D cell-culture models in vitro, the one known as Organ-on-a-Chip has recently gained momentum because it managed to promote levels of cellular differentiation and tissue organization not possible in conventional two-dimensional (2D) culture systems. Dr. Dongeun Dan Huh, who is considered the inventor of Organ-on-a-Chip technology, demonstrated in his famous Science paper: “Reconstituting organ-level lung functions on a chip” that replicating organ architecture is necessary to restore its functions. Element such as delivery of oxygen, spatiotemporal gradients of nutrients, cellular components of the local microenvironment, geometry of the tissue-tissue interface (e.g. between epithelium and vascular endothelium), and mechanical forces acting on cells (e.g. mechanical stretch, air flow on the alveolar epithelium and fluid flow on endothelium) play a crucial role on cell behavior and on our capacity to restore their native functions. Therefore, advancement in biomaterials and tissue engineering will be required to better replicate in a controlled microenvironment the specific aspects of human physiology and to advance the field of tissue engineering and regenerative medicine. Unfortunately, despite the level of sophistication achieved by Dr. Huh with his Lung-on-a-Chip, the model is still failing to reconstitute an essential element of the human living alveolar wall architecture, such as the stroma, which makes the Organ-on-a-Chip model of the lung not fully mature yet, but more a 2D culture on a three-dimensional (3D) artificial surface resembling the natural interface between the tissues that compose the lung.In our efforts to address this limitation, we developed a more comprehensive 3D model of the alveolus by combining the advantages offered by Organ-on-a-Chip technology, we have just described, with the advantages offered by organotypic cultures, which are three-dimensional culture systems where cells are grown using scaffolds made of natural extracellular matrix (ECM) to preserve part of the stroma-epithelium architecture and most of the cellular interactions within the cultured organ. Specifically, by leveraging microfabrication technologies derived from the microchip industry, we manufactured a microfluidic chip that integrates the alveolus stroma with the physical component of the chip; it replicates most of the structural elements of the alveolar wall cross-section and recapitulates the mechanical forces normally acting on the alveolar microenvironments such as mechanical stretch and fluidic shear. An in vitro model of the human alveolus that provides an adequate mimicry of the lung microenvironment could facilitate drug discovery and give new insight on lung disease mechanisms of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), asthma, and idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) or acute injury such as ventilator-associated lung injury (VALI) for which are not available comprehensive models. Most of the existing alveolus models lack the biological architecture, the cellular complexity and the microenvironment mechanical stimuli necessary to recapitulate the disease mechanisms. Here, we describe the development of a tridimensional breathing human “Alveolus-Chip” that incorporates an interstitial compartment populated with lung fibroblasts lined with alveolar and microvascular pulmonary endothelial cells on opposite sides. The interstitial compartment provides structural and functional support to the alveolar epithelium and promotes maturation of tissue-specific markers. We show for the first time that primary human alveolar cells co-cultured together with primary human lung fibroblasts and microvascular endothelial cells, exposed to air and breathing motions, express tissue specific markers and secrete soluble surfactant proteins. Co-culture models that use human primary epithelial, mesenchymal and endothelial cells are particularly important in the contest of drug discovery and drug testing because drug metabolism is a species-specific process and failure in accurately recapitulating the biological, chemical and physical alveolar niche can easily results in cellular in vitro response non predictive of the in vivo response. The Alveolus-Chip model was used to recapitulate some of the key aspects of acute and chronic lung injury caused by oxidative stress, including loss of air-liquid interface, release of pro-inflammatory cytokines, and formation of platelet clots. We demonstrate that vascular administration of therapeutic compounds targeting the Nrf2 pathway protect the Alveolus-Chip from oxidative stress acute injury and reduce inflammatory response. Our study provides a proof of principle of the validity of our biomimetic system by using an organ-chip that reconstitutes alveolar organ-level functions for modeling lung injury, and for testing anti-inflammatory compounds targeting the Nrf2 pathway. Our approach based on better mimicking the native human organ microenvironment enhanced alveolar cell differentiation and partially restored the functions of the alveolus. The encouraging results obtained on Alveolus-Chip model, let us believe that this technology could help improving the functionality of other organ models, help replicating the systemic response of the human body by linking together multiple organ-chip models through an integrated microfluidic circulatory system to serve as replacements for animals in drug testing.

Οι καλλιέργειες κυττάρων in vitro έχουν αποδειχθεί πολύτιμο εργαλείο για την προώθηση της κατανόησης της λειτουργείας και των βιολογικών μηχανισμών που διέπουν την κυτταρική συμπεριφορά in vivo και να αποκρυπτογραφήσουν τους μηχανισμούς που ενέχονται στην νόσο. Για παράδειγμα, οι διδιαστατες (2D) κυτταρικές καλλιέργειες έχουν χρησιμοποιηθεί στην ανακάλυψη φαρμάκων για τη μελέτη των κυτταρικών αποκρίσεων σε βιοφυσικές και βιοχημικές διεγέρσεις για πάνω από έναν αιώνα. Ωστόσο, παρά το γεγονός ότι είναι καλά αποδεκτά και έχουν συμβάλει σημαντικά στην προώθηση της κατανόησής μας για την κυτταρική βιολογία, αυξανόμενες ενδείξεις δείχνουν ότι η κυτταρική συμπεριφορά σε συστήματα 2D αποκλίνει σημαντικά από το in vivo και προβλέπουν τη φυσική κυτταρική απόκριση μόνο υπό συγκεκριμένες συνθήκες. Λόγω αυτών των περιορισμών, έχει γίνει προσπάθεια διερεύνησης εναλλακτικών τρόπων καλλιέργειας και παρατήρησης των βιολογικών ιστών. Ωστόσο, η αναδημιουργία των συνθηκών για την μίμηση βιολογικών λειτουργιών σε επίπεδο οργάνου ή η αναπαραγωγή της φυσικής και παθοφυσιολογικής απόκρισης in vitro είναι δύσκολη, εν μέρει λόγω της περιορισμένης κατανόησης της πολυπλοκότητας του βιολογικού μικροπεριβάλλοντος και της συνολικής μικροαρχιτεκτονικής του ιστού, αλλά και λόγω της περιορισμένης ικανότητάς μας να αναπαράγουμε το συγκεκριμένο όργανο-ιστό ex vivo. Ως αποτέλεσμα, χρησιμοποιούνται συνήθως τα ζωικά μοντέλα για την ανάλυση συστημικού επιπέδου σε μελέτες για τους μηχανισμούς της ανθρώπινης νόσου. Τα ζωικά μοντέλα έχουν συμβάλει σε σημαντικά ευρήματα και ανακαλύψεις στην κατανόηση των υποκείμενων μηχανισμών διαφόρων ασθενειών, ωστόσο η προγνωστική τους αξία είναι συχνά χαμηλή, οδηγώντας σε μεταφραστική στον άνθρωπο αποτυχία, εκτός από το ότι είναι κοστοβόρα και εγείρουν πολλά ζητήματα βιοηθικής Είναι πλέον γνωστό ότι περισσότερο από το 90% των φαρμάκων που εισέρχονται σε κλινικές δοκιμές αποτυγχάνουν, παρά τα θετικά αποτελέσματα σε προκλινικές δοκιμές σε πειραματοζώα. Η αποτυχία στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών έχει δείξει επανειλημμένα ότι τα ζωικά μοντέλα δεν μιμούνται με ακρίβεια τις ανθρώπινες φυσιολογικές αποκρίσεις ή δεν προβλέπουν με ακρίβεια την αποτελεσματικότητα και την τοξικότητα του φαρμάκου στον άνθρωπο λόγω των εγγενών βιολογικών διαφορών που υπάρχουν μεταξύ των διαφόρων ειδών σε γενετικό και ανατομικό επίπεδο. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η τρισδιάστατη βιομιμητική καλλιέργεια που προσομοιώνει το φυσικό κυτταρικό μικροπεριβάλλον μπορεί να πετύχει τα κύτταρα να συμπεριφέρονται φυσιολογικά και ως εκ τούτου να χρησιμοποιηθεί για τη βελτίωση της προκλινικής αποτελεσματικότητας και τοξικότητας των φαρμάκων καθώς και της δοκιμής αποτελεσματικότητας in vitro, προσφέροντας μια εναλλακτική λύση στη χρήση ζωικών μοντέλων. Στοιχεία της φυσικής αρχιτεκτονικής μικροπεριβάλλοντος, συμπεριλαμβανομένων της κυτταρικής και διακυτταρικης σύνθεσης και τοπογραφίας του ιστού, η τριών διαστατική δομική γεωμετρία του καθώς και οι μηχανικές δυνάμεις όπως η διακυτταρικη τάση η κυτταρικη διάταση αντιπροσωπεύουν βασικά συστατικά για την προσομοίωση των φυσιολογικών και παθολογικών λειτουργιών των οργάνων. Τα τρισδιάστατα συστήματα κυτταροκαλλιέργειας που επιτρέπουν την προσομοίωση της in vivo πολυπλοκότητας θα μπορούσαν να γεφυρώσουν το χάσμα μεταξύ πειραματοζώων και ανθρώπων στις προκλινικές μελέτες. Μεταξύ όλων των μοντέλων in vitro οι 3D κυτταροκαλλιέργειας, που είναι γνωστές ως Organ-on-a-Chip κέρδισαν πρόσφατα δυναμική επειδή κατάφεραν να προσομοιάσουν τα επίπεδα της κυτταρικής διαφοροποίησης και της οργάνωσης των ιστών που δεν επιτυγχάνεται σε συμβατικά συστήματα δύο διαστάσεων (2D) ή τρισδιάστατων (3D) καλλιεργειών. Ο Δρ Dongeun Dan Huh, ο οποίος θεωρείται ο εφευρέτης της τεχνολογίας Organ-on-a-Chip, ανέφερε στη περίφημη δημοσίευση του: «Η ανασύσταση των λειτουργιών των πνευμόνων σε επίπεδο οργάνου σε ένα τσιπ» ότι η αναπαραγωγή της αρχιτεκτονικής των οργάνων είναι απαραίτητη για την προσομοίωση των λειτουργιών των ιστών. Στοιχεία όπως παροχή οξυγόνου, χωροχρονικές βιολογικές αποκρίσεις, τα θρεπτικά συστατικά, τα κυτταρικά συστατικά του τοπικού μικροπεριβάλλοντος, η γεωμετρία της διεπαφής μεταξύ των διαφόρων ιστών (π.χ. μεταξύ επιθηλίου και αγγειακού ενδοθηλίου) και οι μηχανικές δυνάμεις που δρουν στα κύτταρα (π.χ. μηχανικές ιστιδικης διάτασης, ροή αέρα στο κυψελιδικό επιθήλιο και ροή υγρού στο ενδοθήλιο) παίζουν καθοριστικό ρόλο στη συμπεριφορά των κυττάρων και στην ικανότητα να εκφράζουν τις φυσικές τους λειτουργίες. Επομένως, απαιτείται πρόοδος στα βιοϋλικά και την μηχανική των ιστών για την ακριβέστερη προσομοίωση των ανθρωπίνων ιστών σε ένα ελεγχόμενο μικροπεριβάλλον συγκεκριμένων πτυχών της ανθρώπινης φυσιολογίας και για την προώθηση του τομέα της μηχανικής των ανθρωπίνων ιστών και της αναγεννητικής ιατρικής. Η προσομοίωση υγιών ή ασθενών πρωτογενών κυψελιδικών φυσιολογικών ανθρώπινων κυττάρων in vitro είναι πολύ περίπλοκη και υπήρξε ιστορικά ανεπιτυχής διότι τα πρωτογενή ανθρώπινα κυψελιδικά κύτταρα είναι πολύ ευαίσθητα στο μικροπεριβάλλον και δεν έχουμε γνώση σχετικά με τις συγκεκριμένες οδούς σηματοδότησης που συμβάλλουν κυρίως στην κυτταρική επιβίωση, διαφοροποίηση και ωρίμανση στο κυψελιδικό μικροπεριβάλλον. Μια κατάσταση που έχει εκ των πραγμάτων περιορίσει έντονα την ικανότητά μας να κατασκευάσουμε in vitro μοντέλα κυψελίδων στα οποία τα πρωτογενή ανθρώπινα κυψελιδικά κύτταρα διατηρούν φαινοτύπους διαφοροποιημένους για ενήλικες, κυτταρικές λειτουργίες και συνθέτουν πρωτεΐνη επιφανειοδραστικού παράγοντα C. Κατά συνέπεια, οι παραδοσιακές in vitro 2D και 3D κυψελιδικές μέθοδοι καλλιέργειας απέτυχαν πλήρως να αναπαραγάγουν τη δομική και λειτουργική φυσιογνωμία του φυσικού κυψελιδικού ιστού και κατέληξαν σε ένα υπερ-απλουστευμένο μοντέλο του ανθρώπινου πνεύμονα, όπου τα περισσότερα από τα βασικά στοιχεία του φυσικού περιβάλλοντος είναι απόντα. Στις προσπάθειές μας να αντιμετωπίσουμε αυτόν τον περιορισμό, αναπτύξαμε μια πιο ολοκληρωμένη πλατφόρμα για την καλλιέργεια τρισδιάστατων μοντέλων ανθρώπινου επιθήλιου συνδυάζοντας τα πλεονεκτήματα που προσφέρει η τεχνολογία Organ-on-a-Chip με πλεονεκτήματα που προσφέρονται από οργανοτυπικές καλλιέργειες, οι οποίες είναι τρισδιάστατα συστήματα καλλιέργειας όπου τα κύτταρα αναπτύσσονται χρησιμοποιώντας ικριώματα κατασκευασμένα από φυσική εξωκυτταρική μήτρα (ECM) για τη διατήρηση μέρους της αρχιτεκτονικής στρώματος-επιθηλίου και των περισσότερων κυτταρικών αλληλεπιδράσεων εντός του καλλιεργημένου οργάνου. Συγκεκριμένα, αξιοποιώντας τεχνολογίες μικροκατασκευής που προέρχονται από τη βιομηχανία των μικροτσίπ, κατασκευάσαμε ένα μικρορευστό τσιπ που ενσωματώνει μια υδρογέλη με το φυσικό συστατικό του τσιπ. Αναπαράγει τα περισσότερα από τα δομικά στοιχεία της διατομής του κυψελιδικού τοιχώματος και προσομοιώνει τις μηχανικές δυνάμεις που συνήθως δρουν στα κυψελιδικά μικροπεριβάλλοντα όπως μηχανική έκταση. Ένα in vitro μοντέλο του ανθρώπινου αναπνευστικού επιθηλίου που παρέχει επαρκή μίμηση του μικροπεριβάλλοντος του πνεύμονα θα μπορούσε να διευκολύνει την ανακάλυψη φαρμάκων και να δώσει νέα εικόνα σχετικά με τους μηχανισμούς της πνευμονικής νόσου της χρόνιας αποφρακτικής πνευμονικής νόσου (ΧΑΠ), του άσθματος και της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης (IPF) ή οξύς τραυματισμός όπως πνευμονική βλάβη που σχετίζεται με αναπνευστήρα (VALI) για την οποία δεν υπάρχουν διαθέσιμα ολοκληρωμένα μοντέλα. Τα περισσότερα από τα υπάρχοντα μοντέλα κυψελίδων δεν διαθέτουν τη βιολογική αρχιτεκτονική, την κυτταρική πολυπλοκότητα και τα μηχανικά ερεθίσματα του μικροπεριβάλλοντος που είναι απαραίτητα για την προσομοίωση των μηχανισμών της νόσου. Στην ερευνητική μας εργασία περιγράφουμε την ανάπτυξη ενός τρισδιάστατου ανθρώπινου αναπνευστικού «Alveolus-Chip» που ενσωματώνει ένα διάμεσο διαμέρισμα περιέχον ινοβλάστες πνευμόνων επενδυμένους με επιθηκθακα πνευμονικά κύτταρα και μικροαγγειακά πνευμονικά ενδοθηλιακά κύτταρα. Το διάμεσο διαμέρισμα παρέχει δομική και λειτουργική υποστήριξη στο κυψελιδικό επιθήλιο και προάγει την ωρίμανση των ειδικών για τον ιστό βιοδείκτες. Δείχνουμε για πρώτη φορά ότι πρωτογενή ανθρώπινα κυψελιδικά κύτταρα συν-καλλιεργούμενα με πρωτογενείς ανθρώπινους πνευμονικούς ινοβλάστες και μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα, εκτεθειμένα σε κινήσεις αέρα και αναπνοής, εκφράζουν συγκεκριμένους βιοδείκτες του ιστού και εκκρίνουν τις σχετικές διαλυτές επιφανειοδραστικές πρωτεΐνες. Τα μοντέλα συν-καλλιέργειας που χρησιμοποιούν ανθρώπινα πρωτογενή επιθηλιακά, μεσεγχυματικά και ενδοθηλιακά κύτταρα είναι ιδιαίτερα σημαντικά στην προσπάθεια της ανακάλυψης φαρμάκων και της δοκιμής φαρμάκων, επειδή ο μεταβολισμός φαρμάκων είναι μια ειδική για κάθε είδος διαδικασία. Το μοντέλο Alveolus-Chip χρησιμοποιήθηκε για να προσομοιώσει μερικές από τις βασικές πτυχές της οξείας και χρόνιας πνευμονικής βλάβης που προκαλείται από οξειδωτικό στρες, συμπεριλαμβανομένης της απώλειας διεπαφής αέρα-υγρού, απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτοκινών και σχηματισμός θρόμβων αιμοπεταλίων. Δείχνουμε ότι η αγγειακή χορήγηση θεραπευτικών ενώσεων με στόχευση της οδού Nrf2 προστατεύει το Alveolus-Chip από οξείες βλάβες οξειδωτικού στρες και μειώνει τη φλεγμονώδη απόκριση. Η προσέγγισή μας βασίστηκε στην καλύτερη μίμηση του φυσικού μικροπεριβάλλοντος των ανθρώπινων πνευμονικών ιστών που υποστήριξε τη διαφοροποίηση των κυψελιδικών κυττάρων και εν μέρει τις λειτουργίες του κυψελίδας. Το μοντέλο Alveolus-Chip, θα μπορούσε να συμβάλει στη βελτίωση της λειτουργικότητας και άλλων μοντέλων οργάνων, να βοηθήσει στην προσομοίωση της συστημικής απόκρισης του ανθρώπινου σώματος, συνδυάζοντας και συνδέοντας πολλαπλά μοντέλα τσιπ οργάνων μέσω ενός ολοκληρωμένου μικρορευστικού κυκλοφορικού συστήματος που θα χρησίμευε στο μέλλον στην αντικατάσταση των πειραματόζωων.