Study on the fate of antimicrobial compounds in Lemna minor constructed wetland systems and investigation of the characteristics of the produced biomass

Abstract

The release of antimicrobials into the environment is a matter of important concern and constitutes a potential threatfor humans’ health as well as terrestrial and aquatic ecosystems. Antimicrobials are partially removed during conventional primary and secondary wastewater treatment and as a result they are often detected in the aquatic environment.Since 2000,they have been detected at ppb or pptevels in a variety of environmental media across the globe. Amongst different plant-based systems used for wastewater treatment, ponds with the duckweed Lemna minor have been appliedsuccessfullyin several countries for the removal of organic matter, nutrients and heavy metals. As this macrophyte is characterized by the high protein or starch content, during the last decade, several studies are also available investigating its cultivation for animals’ feedstock or biofuels’ production. On the other hand, limited information is available for the ability of such systems to remove organic micropollutants and especially antimicrobial compounds. The main goals of the current PhD Thesiswere: a) to estimate the potential environmental risks associated with human consumption of antimicrobials in Greece, b) to study the growth and characteristics of L. minor in human urine and municipal wastewaterandc) to investigate the removal efficiency of antimicrobials in L. minor systemsas well as the role of different abiotic and biotic mechanisms on their elimination. In the first part of the current study, consumption data were collected for the 24 most often used antimicrobials in Greece for years 2008-2010 and their Predicted Environmental Concentrations (PECs) in raw and treated wastewater were calculated using mass balances. The ecotoxicological risk was estimated by calculating the ratio of PEC to Predicted No Effect Concentration (PNEC) for three categories of aquatic organisms (algae, daphnids and fish). Based on acute toxicity data for algae, an ecological threat seems possible for 7 out of 24 target antimicrobials in raw and treated wastewater, while no significant risk was estimated for daphnids and fish. For Greek rivers where low and medium dilution of wastewater occurs, a moderate to high risk is expected due to the existence of individual antimicrobials such as amoxicillin, clarithromycin, ciprofloxacin, azithromycin, erythromycin and levofloxacin in discharged treated wastewater.In the second part of the PhD Thesis, experiments were conducted to study the cultivation of duckweedL. minor in human urine(HU) and the role of different parameters such as urine type, dilution factor, temperature, existence of macro- and microelements on growth rate was investigated. The simultaneous removal of nutrients and selected antimicrobials was also studied in experiments with HU and treated domestic wastewater, while the starch and protein content of the produced biomass was determined. Higher growth rates were observed at 24 oC, using HU stored for 1 d and with dilution factor equal to 1:200. In experiments with HU and wastewater, the removal of COD, total phosphorus and total nitrogen exceeded 80%, 90% and 50%, respectively, while ciprofloxacin and sulfamethoxazole were eliminated by more than 80%. The main removal mechanism for the former antimicrobial wasphotodegradation, while plant uptake and biodegradation seem to be of significant importance for the latter. Crude protein content reached 31.6% in experiments with HU and biomass harvesting, while starch content was enhanced when duckweed was transferred to water for 21 d, reaching 47.1%.In the third part of the PhD Thesis, the use of duckweed-based wastewater treatment systems for producing biomass with high crude protein and starch content was investigated. Three lab-scale systems were used; System 1 was planted with L. minor, System 2 with L.gibba and System 3 with the combination of the two duckweeds. The studied duckweeds were cultivated using secondary treated wastewater as substrate (Phase A), in the presence of excess NH4-N (Phase B) and using water with no nutrients (Phase C). All systems achieved average NH4-N removal higher that 90%. The specific duckweeds growth rates and the specific duckweeds growth rates normalized to the area ranged between 0.14 d−1 and 8.9 g m−2 d−1 (System 1) to 0.19 d−1 and 14.9 g m−2 d−1(System 3). The addition of NH4-N resulted to an important increase of biomass protein content, reaching 44.4% in System 3, 41.9% in System 2 and 39.4% in System 1. The transfer of biomass in water containing no nutrients resulted to the gradual increment of the starch content up to the end of the experiment. The highest starch content was achieved for the combination of the two duckweeds (46.1%), followed by L. gibba (44.9%) and L. minor (43.9%).In the last experimental part of the current PhD Thesis, the fate of four antimicrobials (cefadroxil, CFD; metronidazole, METRO; trimethoprim, TRI; sulfamethoxazole, SMX) was studied in L. minor systems and the role of different mechanisms on their removal was evaluated. All micropollutants were significantly removed in batch experiments with active L. minor and the order from the highest to lower removal was CFD >METRO > SMX > TRI till the end of experiment. Calculation of kinetic constants for hydrolysis, photodegradation, sorption to biomass and plant uptake revealed significant differences depending on the compound and the studied mechanism.For METRO, TRI and SMX the kinetic constants of plant uptake were by far higher comparing to those of the other mechanisms. The transformation productsofantimicrobialswere identified using UHPLC-QToF-MS. Two were the main degradation pathways for TRI; hydroxylation takes place during both phyto- and photodegradation, while demethylation occurs only in absence of L. minor. The operation of a continuous-flow duckweed system showed METRO and TRI removal equal to 71±11% and 61±8%, respectively.The plant uptake and biodegradation were the major mechanisms for METRO removal while the most important mechanism for TRI was plant uptake.

Η απελευθέρωση αντιμικροβιακών ουσιών στο περιβάλλον αποτελεί ένα ζήτημα σημαντικού ενδιαφέροντος για την ανθρώπινη υγεία αλλά και την προστασία του περιβάλλοντος. Οι αντιμικροβιακές ουσίες απομακρύνονται συνήθως σε μικρό ποσοστό κατά τη συμβατική επεξεργασία των λυμάτων και κατά συνέπεια συχνά ανιχνεύονται πολύ συχνά στο υδάτινο περιβάλλον. Από το 2000,οι συγκεκριμένες ουσίες έχουν εντοπιστεί σε συγκεντρώσεις της τάξης των ngL-1ή μgL-1σε μια ποικιλία περιβαλλοντικών μέσων ανά την υφήλιο. Μεταξύ των διαφόρων συστημάτων τεχνητών υγροτόπων που χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία των υγρών αποβλήτων, οι λίμνες που περιέχουν το μακρόφυτοLemnaminorέχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε διάφορες χώρες για την απομάκρυνση του οργανικού υλικού, των θρεπτικών και των βαρεών μετάλλων. Καθώς αυτό το φυτό χαρακτηρίζεται από υψηλό πρωτεινικό περιεχόμενο και μεγάλη περιεκτικότητα σε άμυλο, κατά την τελευταία δεκαετία, διάφορες ερευνητικές εργασίες είναι διαθέσιμες που μελετούν την καλλιέργειά του για την παραγωγή ζωοτροφών ή βιοκαυσίμων. Από την άλλη πλευρά, μέχρι σήμερα ελάχιστη πληροφορία είναι διαθέσιμη για την ικανότητα αυτών των συστημάτων να απομακρύνουν οργανικούς μικρορρύπουςκαι ειδικότερα αντιμικροβιακές ενώσεις. Οι κύριοι στόχοι της παρούσας εργασίας ήτανα) να εκτιμηθούνοι περιβαλλοντικοί κίνδυνοι που συνδέονται με την ανθρώπινη κατανάλωση αντιμικροβιακών ουσιών στην Ελλάδα, β) να μελετηθεί η ανάπτυξη και τα χαρακτηριστικά της L. minorσε ανθρώπινα ούρα και αστικά υγρά απόβλητα και γ) να διερευνηθεί η απομάκρυνση των αντιμικροβιακών ουσιών σε συστήματα L. minorκαθώς επίσης και ο ρόλος των αβιοτικών και βιοτικών μηχανισμών στην απομάκρυνσή τους. Κατά την πρώτη φάση της διδακτορικής διατριβής, πραγματοποιήθηκε συλλογή δεδομένων για την κατανάλωση σκευασμάτων που περιέχουν αντιμικροβιακές ουσίες στην Ελλάδα και εκτιμήθηκαν οι αναμενόμενες περιβαλλοντικές συγκεντρώσεις (predictedenvironmentalconcentration, PEC) στα υγρά απόβλητα χρησιμοποιώντας ισοζύγια μάζας. Έπειτα έγινε συλλογή δεδομένων οξείας τοξικότητας, είτε βιβλιογραφικά, είτε μέσω μοντέλων εκτίμησης οξείας τοξικότητας για τρεις διαφορετικές κατηγορίες υδρόβιων οργανισμών (άλγη, δαφνίδες, ψάρια) με σκοπό να υπολογιστουνοιπροβλεπόμενεςσυγκέντρωσειςπου δεν προκαλουν επιπτώσεις (predictedno-effectconcentration, PNEC). Τέλος, βάσει των παραπάνω δεδομένων εκτιμήθηκε το πηλίκο επικινδυνότητας (riskquotient, RQ) στο υδάτινο περιβάλλον για κάθε έναν οργανισμό ξεχωριστά. Βασιζόμενοι στα δεδομένα οξείας τοξικότητας, πιθανός οικολογικός κίνδυνος φαίνεται για 7 από τις 24 αντιμικροβιακές ουσίες που μελετήθηκαν για τα ανεπεξέργαστα και τα επεξεργασμένα αστικά λύματα, ενώ δεν αναμένεται κάποιος κίνδυνος για τις δαφνίσες και τα ψάρια. Για τα ελληνικά ποτάμια, όπου παρατηρείται μικρή ή μεσαία αραίωση των αποβλήτων, αναμένεται μέσος έως υψηλός κίνδυνος εξαιτίας της παρουσίας των ουσιών amoxicillin, clarithromycin, ciprofloxacin,azithromycin, erythromycinκαιlevofloxacin.Κατά τηδεύτερη φάση της διδακτορικής διατριβής, πραγματοποιήθηκαν πειράματα για να μελετηθεί η καλλιέργεια του μακρόφυτουL. minor σε ανθρώπινα ούρα (ΗU) να εξεταστεί ο ρόλος διαφορετικών παραμέτρων όπως του τύπου των ούρων, του συντελεστή αραίωσης, της θερμοκρασίας και της ύπαρξης μάκρο- και μίκροθρεπτικών στην ταχύτητα ανάπτυξής του. Μελετήθηκε επίσης η ταυτόχρονη απομάκρυνση θρεπτικών και επιλεγμένων αντιμικροβιακών ενώσεων σε πειράματα με ούρα και επεξεργασμένα αστικά λύματα, ενώ διερευνήθηκε το περιεχόμενο της βιομάζας σε άμυλο και πρωτείνες. Υψηλές ταχύτητες αύξησης παρατηρήθηκαν στους 24 οC, χρησιμοποιώντας ούρα αποθηκευμένα για 1 ημέρα και συντελεστή αραίωσης 1:200. Στα πειράματα με ούρα και απόβλητα, η απομάκρυνση του COD, του ολικού φωσφόρου και του ολικού αζώτου ξεπέρασε το 80%, 90% και 50%, αντίστοιχα, ενώ το ciprofloxacin και το sulfamethoxazole απομακρύνθηκαν κατά περισσότερο από 80%. Ο κύριος μηχανισμός απομάκρυνσης της πρώτης ουσίας ήταν η φωτοδιάσπαση, ενώ της δεύτερης η πρόσληψη από τα φυτά και η βιοαποδόμηση. Το πρωτεινικό περιεχόμενο της βιομάζας έφθασε το 31.6% στα πειράματα με τα ούρα, ενώ το περιεχόμενο σε άμυλο αυξήθηκε όταν το φυτό μεταφέρθηκε σε νερό για 21 ημέρες, φθάνοντας το 47.1%. Στην τρίτη πειραματική φάση, πραγματοποιήθηκαν πειράματα με τη χρήση επεξεργασμένων αποβλήτων και δυο φωτοσυνθετικών οργανισμών που ανήκουν στα duckweeds για παραγωγή βιομάζας με υψηλό περιεχόμενο σε πρωτείνες και άμυλο. Χρησιμοποιήθηκαν 3 πειραματικές διατάξεις; το Σύστημα 1 περιείχεL.minor, το Σύστημα 2 L.gibba και το Σύστημα 3 συνδυασμό των παραπάνω οργανισμών.Τα μελετώμενα είδη καλλιεργήθηκαν σε δευτεροβάθμια επεξεργασμένα υγρά απόβλητα (ΦάσηΑ), παρουσία επιπλέον ΝΗ4-Ν (Φάση Β) και παρουσία νερού χωρίς θρεπτικά (Φάση Γ). Όλα τα συστήματα πέτυχαν μέση απομάκρυνση αμμωνιακού αζώτου μεγαλύτερη του 90%. Η ειδική ταχύτητα αύξηση των φυτών κυμάνθηκε μεταξύ 0.14 d−1 (Σύστημα 1) και 0.19 d−1 (Σύστημα 3). ΗπροσθήκηNH4-Nσυνετέλεσεσεσημαντικήαύξησητουπρωτεινικούπεριεχομένουπουέφθασετο 44.4% στο Σύστημα 3, 41.9% στο Σύστημα 2 και 39.4% στο Σύστημα 1. Η μεταφορά της βιομαζας στο νερό που δεν περιείχε θρεπτικά οδήγησε σε βαθμιαία αύξηση της περιεκτικότητας σε άμυλο. Ημεγαλύτερησυγκέντρωσησεάμυλο παρατηρήθηκε για το συνδυασμό των δύο μακροφύτων (46.1%), ακολουθούμενη από τη L. gibba (44.9%) και τηL. minor (43.9%).Στο τελευταίο πειραματικό στάδιο της παρούσας διατριβής, μελετήθηκαν οι μηχανισμοί της υδρόλυσης, φωτοδιάσπασης, προσρόφησης, πτητικοποίησης και η μικροβιακή βιοαποδόμηση τεσσάρων αντιμικροβιακών ουσιών (cefadroxil, CFD; metronidazole, METRO; trimethoprim, TRI; sulfamethoxazole, SMX) σε συστήματα ασυνεχούς τροφοδοσίας που περιείχαν τον οργανισμό L. minor. Όλες οι εξεταζόμενες ουσίες απομακρύνθηκαν σημαντικά στα πειράματα ασυνεχούς τροφοδοσίας, μεγαλύτερη απομάκρυνσηέως το τέλος του πειράματος -κατά φθίνουσα σειρά- παρατηρήθηκε για τις ουσίες CFD>METRO>SMX>TRI. Υπολογισμός των κινητικών σταθερών για την υδρόλυση, φωτοδιάσπαση, ρόφηση στη βιομάζα και πρόσληψη από τα φυτά έδειξε σημαντικές διαφοροποιήσεις ανάλογα με την ουσία και τον μελετούμενο μηχανισμό. Παράλληλα αναγνωριστηκαν τα προιόντα μετατροπής των αντιμικροβιακών ενώσεων με χρήσηUHPLC-QToF-MS. Για την ουσία trimethoprim βρέθηκεότι οι δύο βασικοί οδοί αποδόμησής της είναι η υδροξυλίωση που λαμβάνει χώρα τόσο κατά τη φύτο-αποδόμηση όσο και κατά τη φωτοδιάσπαση και η απομεθυλίωσηπουπαρατηρείται απουσία τηςL. minor. Η λειτουργία ενός συστήματος συνεχούς ροής μεL. minor έδειξε ότι οι ουσίες METRO και TRI απομακρύνθηκαν κατά 71±11% και 61±8%, αντίστοιχα. Η πρόσληψη από τα φυτά και η βιοαποδόμηση ήταν οι βασικοί μηχανισμοί απομάκρυνσης του METRO ενώ η πρόσληψη από τα φυτά για τοTRI.