ΜΕΛΕΤΕΣ ΕΠΙ ΤΗΣ ΠΕΠΤΙΔΥΛΟΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΗΣ ΣΕ ΣΥΣΤΗΜΑ ΑΠΟ ΔΙΚΤΥΟΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΑ ΚΟΥΝΕΛΙΟΥ

Abstract

PEPTIDE BOND FORMATION HAS BEEN STUDIED BY USING A CELL-FREE SYSTEM IN WHICH RABBIT RETICULOCYTE RIBOSOMES CATALYZE THE FORMATION OF A PEPTIDE BOND BETWEEN PUROMYCIN (S) AND AC-PHE-TRNA (FROM E. COLI) WHICH IS PREBOUND TO THE RIBOSOME IN THE PRESENCE OF POLY (U). COMPLEX C (C) I.E. THE {AC-PHE-TRNA - 80S RIBOSOME - POLY (U)} COMPLEX REACTS WITH AN EXCESS OF S AND THIS REACTION (PUROMYCIN REACTION) IS ANALYZED AS A PSEUDO-FIRST ORDER REACTION, GIVING A TIME PLOT,WHICH IS A STRAIGHT LINE. THE SLOPE OF THIS STRAIGHT LINE GIVES THE APPARENTFIRST ORDER RATE CONSTANT (KOBS) AT EACH CONCENTRATION OF PYROMYCIN. THE PLOT OF THE RECIPROCAL OF THE EXPERIMENTAL KOBS VERSUS THE RECIPROCAL OF THE PUROMYCIN CONCENTRATION IS LINEAR AND ALLOWS US TO DETERMINE THE VALUE OF KS (0.29 MM) AND K3 (2.9 M IN-1) (37 C). THE RATE CONSTANT K3 IS A MEASURE OF THE ACTIVITY OF PEPTIDYLTRANSFERASE EXPRESSED AS ITS CATALYTIC RATE CONSTANT (KCAT). BY USING THIS SYSTEM WE HAVE ELUCIDATED: A) THE ROLE OF POTASSIUM IONS INPEPTIDE BONB FORMATION PER SE (PUROMYCIN REACTION), B) THE MODE OF ACTION OF ANISOMYCIN AND C) OF SPARSOMYCIN. DETAILED KINETIC ANALYSIS SUGGESTS THAT: A)POTASSIUM ACTS AS AN ESSENTIAL ACTIVATOR IN THE PUROMYCIN REACTION, B) ANISOMYCIN INHIBITS PUROMYCIN REACTION AND THE TYPE OF INHIBITION IS CHARACTERIZEDAS LINEAR INTERSECTING MIXED NONCOMPETITIVE (KI=0.65 ΜΜ) AND C) SPARSOMYCIN INHIBITS PUROMYCIN REACTION COMBINING INITIALY WITH C IN A TWO-STEP EQUILIBRIUM.

ΠΡΩΤΑΡΧΙΚΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΑΥΤΗΣ ΗΤΑΝ Η ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ, ΤΟ ΟΠΟΙΟ ΘΑ ΕΠΕΤΡΕΠΕ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ PTASE ΣΤΟ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟ ΡΙΒΟΣΩΜΑ. ΓΙΑ ΤΟ ΣΚΟΠΟ ΑΥΤΟ ΑΝΑΠΤΥΧΘΗΚΕ ΣΥΣΤΗΜΑ ΕΛΕΥΘΕΡΟΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΠΟ ΔΙΚΤΥΟΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΑ ΚΟΥΝΕΛΙΟΥ. ΣΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΑΥΤΟ ΤΟ 80S ΡΙΒΟΣΩΜΑ ΚΑΤΑΛΥΕΙ ΤΟ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟ ΤΟΥ ΠΕΠΤΙΔΙΚΟΥ ΔΕΣΜΟΥ ΜΕΤΑΞΥ ΤΗΣ ΠΟΥΡΟΜΥΚΙΝΗΣ (S) ΚΑΙ ΤΟΥ ΔΟΤΗ (AC-PHE-TRNA ΑΠΟ E. COLI), Ο ΟΠΟΙΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΙ ΜΕΡΟΣ ΤΟΥ ΠΡΟΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΙΚΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ C. ΤΟ ΣΥΜΠΛΟΚΟ C {AC-PHE-TRNA - 80S ΡΙΒΟΣΩΜΑ - POLY (U)} ΑΝΤΙΔΡΑ ΜΕ ΠΕΡΙΣΣΕΙΑ S ΚΑΙ Η ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΑΥΤΗ (ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΥΡΟΜΥΚΙΝΗΣ) ΑΝΑΛΥΕΤΑΙ ΩΣ ΜΙΑ ΨΕΥΔΟ-ΠΡΩΤΗΣ ΤΑΞΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ. Η ΧΡΟΝΟΚΑΜΠΥΛΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΥΡΟΜΥΚΙΝΗΣ ΕΙΝΑΙ ΠΑΝΤΑ ΜΙΑ ΕΥΘΕΙΑ ΓΡΑΜΜΗ ΜΕ ΚΛΙΣΗ ΙΣΗ ΠΡΟΣ ΤΗΝ ΤΙΜΗ ΤΗΣ KOBS. ΑΠΟ ΤΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΔΕ ΤΟΥ ΔΙΠΛΟΥ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΟΥ {ΓΡΑΦΙΚΗ ΠΑΡΑΣΤΑΣΗ ΤΩΝ 1/KOBS ΕΝΑΝΤΙ ΤΩΝ 1/(S)} ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΘΗΣΑΝ ΕΠΑΚΡΙΒΩΣ ΟΙ ΤΙΜΕΣ ΤΗΣ KS(0,29 MM) ΚΑΙ ΤΗΣ K3(2,9 M IN-1) (37 C), Η ΟΠΟΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΙ ΜΕΤΡΟ ΤΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ PTASE. Η ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΟΥ ΑΝΩΤΕΡΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΜΑΣ ΕΔΩΣΕ ΤΗ ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΑ ΝΑ ΜΕΛΕΤΗΣΟΥΜΕ: Α)ΤΟ ΡΟΛΟ ΤΩΝ ΙΟΝΤΩΝ ΚΑΛΙΟΥ ΚΑΤΑ ΤΟ ΣΤΑΔΙΟ ΤΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΠΕΠΤΙΔΙΚΟΥ ΔΕΣΜΟΥ, Β) ΤΟ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΝΙΣΟΜΥΚΙΝΗΣ ΚΑΙ Γ) ΤΗΣ ΣΠΑΡΣΟΜΥΚΙΝΗΣ. ΛΕΠΤΟΜΕΡΗΣ ΚΙΝΗΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΔΕΙΞΕ ΟΤΙ: Α) ΤΟ ΙΟΝ ΤΟΥ ΚΑΛΙΟΥ ΔΡΑ ΩΣ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΟΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗΣ (ESSENTIAL ACTIVATOR) ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΠΟΥΡΟΜΥΚΙΝΗΣ, Β) Η ΑΝΙΣΟΜΥΚΙΝΗ ΑΝΑΣΤΕΛΛΕΙ ΤΗΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΟΥΡΟΜΥΚΙΝΗΣ ΑΚΟΛΟΥΘΩΝΤΑΣ ΤΕΛΕΙΑ ΜΙΚΤΗ ΜΗ ΣΥΝΑΓΩΝΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ (KI=0,65 ΜM). (ΠΕΡΙΚΟΠΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗΣ)