Μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας και των εξελικτικών σχέσεων ρετροϊών που προσβάλλουν τα πρόβατα και ανάπτυξη μοριακών δοκιμών για την ανίχνευσή τους

Abstract

Retroviruses (family Retroviridae) replicate by converting the RNA genome into the DNA intermediate via the process of reverse transcription. Clinical manifestations of retroviral infections include immunodeficiency syndromes, oncogensesis and chronic reticuloendothelial disease. Amongst them, small ruminant lentiviruses (SRLVs) and enzootic nasal tumor virus (ENTV-1, -2) of sheep and goats are of significant interest research-wise. The aims of this thesis were: A) Sequencing part of the viral genome of SRLVs and ENTV-1 strains circulating in Greece and studying their genetic heterogeneity B) Developing and validating fast and reliable molecular diagnostic protocols, able to detect the presence of the aforementioned viruses in pathological samples. In this regard, emphasis was given to the capability of the developed ENTV-1 protocols to specifically detect ENTV-1strains and not genetically related endogenous retroviruses. Elseways, the main developmental aim of the SRLVs protocols was the capability to detect a broad range of diverse viral strains.Small ruminant lentiviruses are highly diverse retroviruses infecting sheep and goats. They induce a slow progressing, lifelong systemic infection that may affect in parallel an array of target organs, such as lung, central nervous system, mammary gland and joints. Control programs rely on fast and accurate diagnosis of the infection, since there is no available cure or effective vaccine. Although PCR-based testing is being utilized for diagnostics, its application is hampered by various factors. These include, among others, the exceptionally high genetic variability of SRLVs, as well as the low number of infected blood monocytes. For this reason, a highly sensitive and specific semi-nested real-time PCR for proviral DNA detection and quantification was developed. The method is innovative in that a) its design is based on selecting the preferred codon usage in the targeted conserved genomic regions and b) oligospermine-conjugated degenerate primers with increased Tm were utilized. Modifications permitted primer/template duplex formation in the cases of mismatches due to sporadic nucleotide polymorphisms in a number of variant SRLVs strains and, consequently, the detection of highly diverse SRLVs strains. The potential loss of analytical sensitivity and specificity was counterbalanced by including a semi-nested step in combination with LNA probes. An in silico procedure for the evaluation of hybridization efficiency of the designed oligonucleotides to all known targeted variants was implemented and proved their capability to amplify part of the pol gene of the majority of known SRLVs strains. The method presents a linear range of quantification over a 3-log10 range and a limit of detection of 3.9 proviral dsDNA copies per reaction. The diagnostic performance of the developed semi-nested real-time PCR was evaluated by testing 72 field samples from seropositive and seronegative animals of 12 Greek flocks. SRLVs were detected in 31 out of 36 seropositive (86%) and 10 out of 36 (28%) seronegative animals. In order to further increase the diagnostic sensitivity, a DNA extraction protocol from blood leukocytes was developed and evaluated so as to increase DNA yield. A minimum of 500 ng of input DNA is recommended for PCR-based detection of SRLV proviral DNA, given the low numbers of infected blood monocytes. Phylogenetic analysis of 24 of the detected strains, revealed high heterogeneity of the Greek SRLV strains while indicating the presence of 9 potential novel subtypes in genotype A and one in genotype B.The oncogenic enzootic nasal tumor viruses (ENTV-1,-2) of sheep and goats respectively, belong to the genus Betaretrovirus. They cause neoplastic transformation of secretory epithelial cells in the upper respiratory tract of small ruminants. Diagnosis is mainly relied on autopsy and histopathology. Molecular detection assays are partly hampered by the heterogeneity of viral strains as well as the existence of numerous homologous endogenous retroviral sequences. Consequently, the genetic distances of ENTV-1 strains are not adequately investigated and there is no real-time PCR method available for ENTV-1 detection. One of the main objectives of this thesis was the development of rapid and low cost molecular methodologies for the detection of ENTV-1 strains. A 3΄-RACE methodology was developed and proved to be able to successfully amplify the U3R genomic region of exogenous betaretroviruses and not of their endogenous counterparts. U3R region is highly polymorphic among betaretroviruses thus allowing the design of specific primers. The initial molecular characterization of three ENTV-1 strains from Cyprus using the aforementioned methodology, allowed the design of a specific PCR and the amplification and sequencing of env (TM) gene, followed by phylogenetic analysis of 14 ENTV-1 strains originating from various flocks located in Cyprus. The analysis indicated that a single viral strain was introduced to Cyprus and was subsequently spread to many flocks around the island, since all of the sequences were grouped in a distinct phylogenetic clade and shared a high overall percentage of nucleotide sequence identity. A Greek strain was also detected in an archived neoplastic tissue DNA sample and analyzed for the first time, confirming the presence of ENTV-1 in Greece. The Greek strain was phylogenetically related to Canadian and Spanish strains. Moreover, the aforementioned phylogenetic analysis, allowed the identification of conserved regions of env (TM) ENTV-1 gene and the subsequent development a highly sensitive, low cost qRT-PCR protocol for the ante-mortem detection of ENTV-1, that could potentially be used in ENTV-1 control and eradication programs worldwide. Field evaluation of the qRT-PCR by testing RNA samples from a Cyprus flock, confirmed the high diagnostic sensitivity of the methodology since ENTV-1 was even detected in asymptomatic animals. Further experimentation, revealed that the best sampling and storage procedure in order to increase ante-mortem diagnostic sensitivity was swabbing both nostrils and storing the Dacron swab-ends in a microcentrifuge tube containing a GuHCl solution.

H οικογένεια Retroviridae αποτελείται από ιούς οι οποίοι ενσωματώνουν το γενετικό τους υλικό στο γονιδίωμα του ξενιστή. Προκαλούν κυρίως σύνδρομα ανοσοανεπάρκειας και/ή ογκογένεση, καθώς και χρόνια, βραδέως εξελισσόμενη νόσο του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος. Ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον στα πρόβατα παρουσιάζουν οι lenti-ιοί των μικρών μηρυκαστικών (small ruminant lentiviruses, SRLVs) και ο ιός του ενζωοτικού ενδορρινικού νεοπλάσματος των προβάτων (Εnzootic nasal tumor virus, ENTV-1). Η διατριβή που εκπονήθηκε είχε 2 κύριους στόχους: α) τον προσδιορισμό τμήματος των γονιδιών env και pol του ENTV-1 και των SRLVs αντιστοίχως για τη μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας και των εξελικτικών σχέσεων των στελεχών που κυκλοφορούν στην Ελλάδα, και β) Την ανάπτυξη μοριακών δοκιμών για την αξιόπιστη ανίχνευση των προαναφερθέντων ιών σε παθολογικά υλικά. Σε ό,τι αφορά τον ENTV-1, ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στη δυνατότητα διαχωρισμού του ιού αυτού από συγγενείς εξωγενείς β-ρετροϊούς καθώς και απο ενδογενείς β-ρετροϊούς οι οποίοι απαντώνται φυσιολογικά στο γονιδίωμα των μικρών μηρυκαστικών. Αντίστοιχα, στην περίπτωση των SRLVs δόθηκε έμφαση στην ανάπτυξη δοκιμής με μεγάλο εύρος ανίχνευσης διαφορετικών ιικών στελεχών όλων των διεθνώς χαρακτηρισμένων γενότυπων (γενότυποι Α-Ε). Οι SRLVs είναι ιοί που χαρακτηρίζονται από μεγάλη γενετική ποικιλομορφία και προσβάλουν τα μικρά μηρυκαστικά. Προκαλούν επίμονη και ισόβια λοίμωξη, η οπoία χαρακτηρίζεται από μεγάλο χρόνο επώασης (μήνες η και χρόνια) ενώ προσβάλλονται πολλά όργανα και κυρίως οι πνεύμονες, οι μαστικοί αδένες, οι αρθρώσεις καθώς και το κεντρικό νευρικό σύστημα. Ο έλεγχος των λοιμώξεων των μικρών μηρυκαστικών που προκαλούνται από τους lenti-ιούς στηρίζεται στην έγκυρη και έγκαιρη εργαστηριακή διάγνωση με στόχο την απομάκρυνση των μολυσμένων ζώων από τις εκτροφές, καθώς η χρήση εμβολίων, θεωρείται αναποτελεσματική και θεραπεία δεν υπάρχει. Η εργαστηριακή μοριακή διάγνωση των λοιμώξεων από SRLVs δυσχεραίνεται κυρίως από τη μεγάλη γενετική παραλλακτικότητά τους και τον χαμηλό αριθμό των μονοκυττάρων του περιφερικού αίματος τα οποία προσβάλλονται κατά την λοίμωξη. Για τον λόγο αυτό, αναπτύχθηκε πρωτόκολλο ημι-ένθετης PCR πραγματικού χρόνου για την ανίχνευση του DNA προϊού των SRLVs σε ζωντανά ζώα. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε χαρακτηρίζεται από μεγάλη διαγνωστική ευαισθησία και ειδικότητα, ενώ παράλληλα διαθέτει τις εξής καινοτομίες: α) Ο σχεδιασμός των ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν, στηρίχθηκε στην επιλογή τους με βάση τον υπολογισμό της συχνότητας χρήσης των κωδικωνίων (codon usage) στις γονιδιωματικές περιοχές-στόχους και β) χρησιμοποιήθηκαν «εκφυλισμένοι» εκκινητές, στους οποίους ενσωματώθηκαν 5 μονάδες κατιονικής σπερμίνης (zip nucleic acids, ZNAs) με στόχο την αύξηση της θερμοκρασίας τήξης (melting temperature, Tm). Οι παραπάνω τροποποιήσεις, επέτρεψαν τον υβριδισμό των εκκινητών στο εκμαγείο-στόχο ακόμα και σε περιπτώσεις που αυτό εμφάνιζε σποραδικούς νουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς, με αποτέλεσμα την δυνατότητα ανίχνευσης στελεχών SRLVs με μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα. Η μείωση της αναλυτικής ευαισθησίας και ειδικότητας της δοκιμής λόγω των προαναφερθέντων τροποποιήσεων των εκκινητών, αντιμετωπίστηκε με την εισαγωγή ενός δεύτερου γύρου ενίσχυσης στην αντίδραση και την συνδυαστική χρήση ανιχνευτών TaqMan με ενσωματωμένα κλειδωμένα νουκλεϊκά οξέα (locked nucleic acids, LNAs). Η in silico αξιολόγηση και ο προσδιορισμός του προφίλ υβριδισμού των εκκινητών και των ανιχνευτών TaqMan κατέδειξαν ότι η συντριπτική πλειοψηφία των διαθέσιμων στη GenBank αλληλουχιών pol των SRLVs θα ενισχυθεί επιτυχώς κατά την διενέργεια ημι-ένθετης PCR πραγματικού χρόνου. Η δοκιμή παρουσίασε γραμμικό εύρος ποσοτικοποίησης 3 log10 (3 – 3000) αντίγραφα DNA προϊού ανά αντίδραση και όριο ανίχνευσης τα 3,9 αντίγραφα DNA προϊού ανά αντίδραση. Η διαγνωστική απόδοση της δοκιμής αξιολογήθηκε σε σύνολο 72 οροθετικών και οροαρνητικών δειγμάτων από 12 ποίμνια προβάτων και αιγών. Το γονιδίωμα του προϊού των SRLVs ανιχνεύθηκε σε 31 από τα 36 οροθετικά (ELISA) δείγματα (86%), ενώ 10 από τα 36 (28%) οροαρνητικά εξεταζόμενα ζώα ήταν επίσης θετικά στην PCR. Παράλληλα, και με στόχο την περεταίρω αύξηση της διαγνωστικής ευαισθησίας της δοκιμής, αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε πρωτόκολλο εκχύλισης DNA από τα λευκοκύτταρα του περιφερικού αίματος με υψηλή απόδοση. Η αξιολόγηση κατέδειξε ότι για την ανίχνευση των SRLVs με PCR, ενδείκνυται η χρήση εκχυλισμάτων με συγκέντρωση DNA τουλάχιστον 500 ng, εξαιτίας του χαμηλού ποσοστού των μολυσμένων μονοκυττάρων. Η φυλογενετική ανάλυση που διενεργήθηκε σε 24 στελέχη SRLVs, κατέδειξε ότι οι ιοί αυτοί χαρακτηρίζονται από μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα στην Ελλάδα, με 9 στελέχη να προσδιορίζονται ως πιθανοί νέοι υπότυποι του γενότυπου Α, και 1 του γενότυπου Β. Οι ιοί του ενζωοτικού ενδορρινικού νεοπλάσματος των προβάτων (ΕΝΤV-1) και των αιγών (ENTV-2) ανήκουν στο γένος Betaretrovirus. Προκαλούν αδενοκαρκίνωμα (EEN) στις ηθμοειδείς ρινικές κόγχες των μικρών μηρυκαστικών, εξαιτίας της προσβολής των επιθηλιακών κυττάρων του ρινικού βλεννογόνου. Η διάγνωση του νοσήματος στηρίζεται πρωτίστως στα νεκροτομικά και ιστοπαθολογικά ευρήματα. H μη επαρκώς διερευνημένη γενετική παραλλακτικότητα των ιικών στελεχών του ENTV, καθώς και η ύπαρξη ενδογενών β-ρετροϊών στα ζώα, δυσχεραίνουν σημαντικά την ανίχνευση και το μοριακό χαρακτηρισμό τους. Ως αποτέλεσμα οι εξελικτικές τους σχέσεις είναι ανεπαρκώς μελετημένες διεθνώς, ενώ δεν έχουν αναφερθεί αξιόπιστες μοριακές δοκιμές που βασίζονται στη PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR) για τη διάγνωση του ΕΕΝ στα πρόβατα. Στόχος της διατριβής ήταν η ανάπτυξη αξιόπιστων τεχνικών μοριακής ανίχνευσης του ΕΝΤV-1. Αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος 3΄-RACE για το μοριακό χαρακτηρισμό των β-ρετροϊών, ικανή να ανιχνεύει τον ENTV-1 και τον ENTV-2 και να τους διαχωρίζει από τους ενδογενείς β-ρετροϊούς. Η μέθοδος επέτρεψε τον εύκολο προσδιορισμό τμήματος της αλληλουχίας της περιοχής U3R η οποία παρουσιάζει ικανή γενετική παραλλακτικότητα έτσι ώστε να εξασφαλίσει τον διαχωρισμό του ENTV-1 από τους ενδογενείς β-ρετροϊούς καθώς και από τους εξωγενείς ENTV-2 και JSRV και είναι χρήσιμη για τον σχεδιασμό ειδικών εκκινητών. Με βάση τον αρχικό μοριακό χαρακτηρισμό τριών κυπριακών στελεχών του ENTV-1, σχεδιάστηκε ειδική PCR για την ενίσχυση και αλληλούχιση τμήματος του γονιδίου env (περιοχή ΤΜ) και της περιοχής U3 του ENTV-1 σε 14 στελέχη από διαφορετικές εκτροφές της Κύπρου. Η φυλογενετική ανάλυση κατέδειξε ότι τα κυπριακά στελέχη ομαδοποιούνται σε διακριτό κλάδο και παρουσιάζουν πολύ μικρές εξελικτικές αποστάσεις μεταξύ τους, γεγονός που υποδηλώνει μοναδικό γεγονός εισόδου ενός στελέχους ENTV-1 στην Κύπρο και κατόπιν μετάδοση του σε εκτροφές του νησιού. Επιπλέον στην παρούσα μελέτη για πρώτη φορά εντοπίσθηκε και χαρακτηρίσθηκε ελληνικό στέλεχος ENTV-1 σε αρχειακό εκχύλισμα DNA από νεοπλασματικές αλλοιώσεις, το οποίο ομαδοποιήθηκε σε κλάδο που περιλαμβάνει καναδικά και ισπανικά στελέχη. Οι αλληλουχίες του γονιδίου env (ΤΜ) του ENTV-1 που προσδιορίσθηκαν, έκαναν εφικτή την εύρεση ειδικών συντηρημένων περιοχών και την ανάπτυξη ευαίσθητης και αξιόπιστης ποσοτικής δοκιμής αντιστροφής μεταγραφής PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR). Η qRT-PCR επιτρέπει την ειδική και ευαίσθητη ανίχνευση του ENTV-1 σε ζωντανά ζώα αποτελώντας ένα αποτελεσματικό, χαμηλού κόστους διαγνωστικό εργαλείο, χρήσιμο σε προγράμματα επιτήρησης ή/και εκρίζωσης του ΕΕΑ. H αξιολόγηση της qRT-PCR σε ποίμνιο προβάτων της Κύπρου, κατέδειξε την υψηλή ευαισθησία της, καθώς η δοκιμή ανίχνευσε τον ιό ακόμα και σε ασυμπτωματικά ζώα-φορείς. Ο βέλτιστος τρόπος δειγματοληψίας και συντήρησης των δειγμάτων κατά την μεταφορά τους, για την ευαίσθητη μοριακή ανίχνευση του ENTV-1 σε ζωντανά ζώα είναι η εμβάπτιση των άκρων των στειλεών από την αριστερή και τη δεξιά ρινική κοιλότητα σε ρυθμιστικό διάλυμα υδροχλωρικής γουανιδίνης εντός ενός σωληναρίου μικροφυγοκέντρου.