Μελέτη της επίδρασης παρεμποδιστών της αναπνευστικής αλυσίδας στο μεταβολισμό μυκήτων του γένους Aspergillus, με εφαρμογή μοριακής γενετικής και μεταβολομικής

Abstract

The aim of the doctoral dissertation is by using innovative "omics" techniques and the model organism Aspergillus nidulans, to study the mechanisms that affect the uptake, detoxification, and excretion of the fungicide boscalid, the main representative of the succinate dehydrogenase inhibitors. A strain genetically inactivated in all 7 genes encoding transporters that control the active uptake of purines showed reduced sensitivity to boscalid. After physiological and toxicological bioassays, the role of the UapC transporter in the active uptake of boscalid was found. The effect of boscalid on the metabolism of isogenetic strains expressing or genetically lacking boscalid-related nucleobase transporters by employing metabolomics was investigated. The effect of boscalid on the germination of conidiospores of the fungus was further investigated, first with a pilot study to understand the underlying mechanism, followed by the study of the toxicity of boscalid in it. The results showed a similar effect of d.o. as in the case of metabolic analysis of mycelial hyphae. To clarify the effect of SDHIs on the metabolism of the fungus, proteomic and metabolic analysis was applied. In boscalid presence an accumulation of succinate and reduced levels of fumarate was recorded, with increased levels of three of the four subunits of the target enzyme. Also, enzymes and metabolites with a role in detoxification, were expressed to address the toxic effect of boscalid. The fact that the expression of AtrB and AtrD ABC transporters seem to increase 6 days post-treatment, led to the study of their impact in boscalid toxicity. Strains were constructed with the corresponding genes deleted and overexpressed, followed by physiological and toxicological bioassays. The discovery of transporters involved in the active uptake or excretion of antifungal compounds that are poorly studied or even uncharacterized, is likely to lead to the discovery of new mechanisms of resistance. Additionally, the fact that trehalose hydrolysis proved to play an important role in the breakage of conidial dormancy, with the subsequent role of of glycerol in germination, highlights their biosynthetic pathways as promising targets for novel and improved PPPs.

Στόχος της διδακτορικής διατριβής είναι μέσω της αξιοποίησης καινοτόμων “ομικών” τεχνικών και χρησιμοποιώντας τον πρότυπο ασκομύκητα Aspergillus nidulans, να μελετηθούν οι μηχανισμοί που επηρεάζουν την πρόσληψη, αποτοξικοποίηση και απέκκριση του μυκητοκτόνου boscalid, του κυριότερου εκπροσώπου της ομάδας των παρεμποδιστών της αφυδρογονάσης του ηλεκτρικού οξέος. Στέλεχος με διαγεγραμμένα επτά γονίδια που κωδικοποιούν μεταφορείς που ελέγχουν την ενεργή πρόσληψη πουρινών, εμφάνισε μειωμένη ευαισθησία στο boscalid. Έπειτα από φυσιολογικές και τοξικολογικές βιοδοκιμές, βρέθηκε ο ρόλος του UapC μεταφορέα στην ενεργή πρόσληψη της δ.ο., Με εφαρμογή μεταβολομικής μελετήθηκε η επίδραση του boscalid στο μεταβολισμό των ισογεννετικών στελεχών που υπερεκφράζουν ή έχουν διαγεγραμμένα γονίδια που κωδικοποιούν μεταφορείς πουρινών, οι οποίοι σχετίζονται με την πρόσληψη της δ.ο.. Διερευνήθηκε επιπλέον η επίδραση του boscalid στην εκβλάστηση των κονιδιοσπορίων του μύκητα, αρχικά με πιλοτικό πείραμα μελέτης και κατανόησης της φυσιολογίας της χρονικής της εξέλιξης και ακολούθως της μελέτης της τοξικότητας του boscalid σε αυτήν. Από τα αποτελέσματα φάηκε παρόμοια επίπτωση της δ.ο. όπως και στην περίπτωση της μεταβολομικής ανάλυσης των μυκηλιακών υφών. Προκειμένου να αποσαφηνιστεί η επίδραση της δ.ο. ακολούθησε πρωτεομική και μεταβολομική ανάλυση. Παρουσία της βρέθηκε συσσώρευση ηλεκτρικού και μειωμένα επίπεδα φουμαρικού οξέος και αυξημένα επίπεδα τριών εκ των τεσσάρων υπομονάδων του ενζύμου στόχου. Επίσης, ένζυμα και μεταβολίτες με ρόλο κατά την αποτοξικοποίηση, εκφράστηκαν ώστε να αντιμετωπιστεί η τοξική επίδραση της δ.ο.. Το γεγονός ότι η έκφραση των AtrB και AtrD ABC μεταφορέων, φαίνεται να αυξάνει στις 6 ημέρες, οδήγησε στη μελέτη της συσχέτισης της δράσης τους με την ευαισθησία στο boscalid. Κατασκευάστηκαν στελέχη με διαγεγραμμένα και υπερεκφρασμένα τα αντίστοιχα γονίδια και ακολούθησαν φυσιολογικές και τοξικολογικές βιοδοκιμές. Η ανακάλυψη για πρώτη φορά μεταφορέων που συμμετέχουν στην ενεργή προσρόφηση μυκητοκτόνων, αλλά και απεκκριτικών μεταφορέων μη μελετημένων, καθιστά πιθανή την ανακάλυψη νέων μηχανισμών ανθεκτικότητας. Επιπλέον, το γεγονός ότι η υδρόλυση της τρεχαλόζης βρέθηκε ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην άρση του λήθαργου και ο μετέπειτα ρόλος της γλυκερόλης στην εκβλάστηση των κονιδιοσπορίων, υποδεικνύουν τα βιοσυνθετικά τους μονοπάτια ως πολλά υποσχόμενους στόχους για την ανάπτυξη νέας γενιάς Φ.Π.