Computational studies for protein structure and function prediction

Abstract

Membrane proteins can be found widely in all living cells where they play a crucial role in the metabolic pathways (Cymer et al., 2015). According to the nature of membrane-protein interactions, we can classify membrane proteins into two broad categories: integral proteins and peripheral ones. Integral membrane proteins (IMPs) play a vital role in cell tasks and communication. IMPs represent roughly 20-30% of the human genome. They can be structurally divided into two distinct categories, the α-helical membrane proteins and the β-barrel ones (von Heijne, 1999). β-barrel outer membrane proteins (βOMPs) are important components of the outer membranes of chloroplasts, mitochondria and Gram-negative bacteria (Schulz, 2002). They play a vital role in signaling and membrane biogenesis. They also carry out a series of significant cellular functions including acting as transporters, porins, enzymes, virulence factors and receptors (Fairman et al., 2011). βOMPs play a crucial role in the connection of the double membrane-bound organelles with the rest of the cell. β-barrel channels arrange the movement of organellar pre-proteins that are synthesized in the cytosol towards the organelle and allow the flux of a large number of metabolites (Hagan et al., 2011; Jores et al., 2016; Paschen et al., 2003; Voulhoux et al., 2003; Wiedemann et al., 2003; Wu et al., 2005). The presence of β-barrels in these organelles also supports the hypothesis that chloroplasts and mitochondria evolved from prokaryotic ancestors as the endosymbiotic theory suggests (Dolezal et al., 2006). The βOMPs also form a defensive line for Gram-negative bacteria against the invasion from pathogens and the subsequent infections, while, at the same time, performing a lot of crucial functions within the cell like cell signaling, adhesion and nutrient import (Noinaj et al., 2015). 2 Transport of nuclear-encoded proteins into the mitochondria is mediated by distinct multi-subunit translocation machineries located in the outer and inner membranes of mitochondria. The mitochondrial entry gate for these preproteins is formed by the translocase of the outer mitochondrial membrane (TOM). From the TOM complex, β-barrel precursors are relayed to another complex in the outer membrane which was termed TOB complex (topogenesis of mitochondrial outer membrane β-barrel proteins) or SAM complex (sorting and assembly machinery). The latter complex mediates the insertion of the β-barrel precursors into the outer membrane (Kozjak et al., 2003; Paschen et al., 2003; Wiedemann et al., 2003). The question why these mitochondrial βOMPs reach only this organelle is still open. Recently, a signature motif termed β-hairpin composed of highly hydrophobic residues is a mitochondrial targeting signal for β-barrel proteins (Jores et al., 2016). Our first goal is to fully characterize the families of mitochondrial and chloroplast βOMPs. Even though several of these families are already known in the literature (i.e. there is experimentally derived evidence for the location and function of the proteins), the computational characterization for these families is missing, and the PFAM database (El-Gebali et al., 2019) which is the most accurate and complete protein family database, includes only a few profiles from characteristic families. It is worth mentioning that the eukaryotic porin family (PFAM: PF01459) contains two quite different proteins, the voltage-dependent anion channel (VDAC) and the translocase of the outer mitochondrial membrane (TOM40). Even though these two families show high diversity in their amino acid sequences (Cavalier-Smith, 2006; Maćašev et al., 2004; Paschen et al., 2003), they are still classified under the same family in PFAM (El-Gebali et al., 2019). Here, we present, a comprehensive computational analysis of eukaryotic transmembrane βOMPs, where we gathered all the known chloroplastic and mitochondrial βOMP families and studied their amino acid3sequence characteristics. This analysis is based on a detailed literature search and the construction of specific profiles for each of these families. Finally, we study the frequency of all eukaryotic transmembrane βOMP families in the reference proteomes of eukaryotic organisms and provide annotation for a large number of previously uncharacterized proteins. Our second goal is to convert OMPdb (Tsirigos et al., 2011), a database of bacterial βOMPs, into a global hub for all βOMPs either eukaryotic or prokaryotic ones. Since 2011, OMPdb acted as a repository for the bacterial βOMPs and is until now the most complete collection of Gram-negative bacteria βOMPs. It has been updated continuously using a collection of characteristic profile Hidden Markov Models (Tsirigos et al., 2011). In the second major version of OMPdb, the number of families has increased ultimately to a total of 129. New additions have been made in parallel with efforts to update existing families and add novel families. Here, we present the upgrade of OMPdb, which from now on aims to will become a global repository for all β-barrel proteins, both eukaryotic and bacterial. Our third goal is to develop a computational method based on Hidden Markov Model to identify all mitochondrial transmembrane βOMPs.

Υπολογιστικές μελέτες πρόγνωσης δομής και λειτουργίας πρωτεϊνών. Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες συναντώνται ευρέως σε όλα τα ζωντανά κύτταρα όπου διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στα μεταβολικά μονοπάτια (Cymer et al., 2015). Με βάση την φύση των αλληλεπιδράσεων μεμβράνης-πρωτεΐνης, μπορούμε να κατατάξουμε τις μεμβρανικές πρωτεΐνες σε δύο μεγάλες κατηγορίες: τις διαμεμβρανικές και τις περιφερειακές. Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες (IMPs) παίζουν ζωτικό ρόλο στις κυτταρικές διεργασίες και στην κυτταρική επικοινωνία. Αντιπροσωπεύουν περίπου το 20-30% του ανθρώπινου γονιδιώματος. Μπορούν να χωριστούν με βάση τα δομικά χαρακτηριστικά τους σε δύο διακριτές κατηγορίες: τις α-ελικοειδείς διαμεμβρανικές πρωτεΐνες και τα β-βαρέλια (von Heijne, 1999).Τα διαμεμβρανικά β-βαρέλια της εξωτερικής μεμβράνης (βΟΜΡ) είναι σημαντικά συστατικά των εξωτερικών μεμβρανών των χλωροπλαστών, των μιτοχονδρίων και των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων (Schulz, 2002). Παίζουν κεντρικό ρόλο στη σηματοδότηση και τη βιογένεση μεμβρανών και πραγματοποιούν μια σειρά σημαντικών κυτταρικών λειτουργιών συμπεριλαμβανομένης της δράσης ως μεταφορέων, πορινών, ενζύμων, παραγόντων μολυσματικότητας και υποδοχέων (Furer et al., 2011). Επιπλέον, τα διαμεμβρανικά β-βαρέλια παίζουν καθοριστικό ρόλο στη σύνδεση των οργανιδίων διπλής μεμβράνης με το υπόλοιπο κύτταρο. Συγκεκριμένα, τα κανάλια διευθετούν την μεταφορά προς το οργανίδιο προ-πρωτεϊνών του που συντίθενται στο κυταρόπλασμα και επιτρέπουν τη ροή πολυάριθμων μεταβολιτών (Hagan et al., 2011; Jores et al., 2016; Paschen et al., 2003; Voulhoux) et al., 2003; Wiedemann et al., 2003; Wu et al., 2005). Η παρουσία β-βαρελιών σε αυτά τα οργανίδια υποστηρίζει περαιτέρω την υπόθεση ότι οι χλωροπλάστες και τα μιτοχόνδρια εξελίχθηκαν από προκαρυωτικούς προγόνους όπως προτείνει η ενδοσυμβιωτική θεωρία (Dolezal et al., 2006). Τα διαμεμβρανικά β-βαρέλια σχηματίζουν επίσης μια αμυντική γραμμή για τα Gram-αρνητικά βακτήρια κατά της εισβολής παθογόνων και των επακόλουθων μολύνσεων, ενώ εκτελούν πολλές σημαντικές λειτουργίες εντός του κυττάρου, όπως η κυτταρική σηματοδότηση, η κυτταρική προσκόληση και η εισαγωγή θρεπτικών συστατικών (Noinaj et al., 2015). Η μεταφορά στα μιτοχόνδρια των πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται στον πυρήνα πραγματοποιείται από διακριτές πρωτεϊνικές «μηχανές» μεταφοράς αποτελούμενες από πολλές υπομονάδες, οι οποίες εντοπίζονται στις εξωτερικές και εσωτερικές μεμβράνες των μιτοχονδρίων. Η πύλη εισόδου των μιτοχονδρίων για αυτές τις προ-πρωτεΐνες σχηματίζεται από την τρανσλοκάση της εξωτερικής μεμβράνης του μιτοχονδρίου (TOM). Μέσω του συμπλέγματος TOM, τα πρόδρομα β-βαρέλια μεταφέρονται σε ένα άλλο σύμπλοκο στην εξωτερική μεμβράνη, το σύμπλοκο TOB (Topogenesis of mitochondrial outer membrane β-barrel proteins) ή το σύμπλοκο SAM (Sorting and Assembly Machinery). Το τελευταίο σύμπλοκο μεσολαβεί στην εισαγωγή των προδρόμων β-βαρελιών στην εξωτερική μεμβράνη (Kozjak et al., 2003; Paschen et al., 2003; Wiedemann et al., 2003). Ο λόγος για τον οποίο αυτά τα μιτοχονδριακά β-βαρέλια καταλήγουν αποκλειστικά στο μιτοχόνδριο είναι ακόμα ασαφής. Πρόσφατα, ένα χαρακτηριστικό μοτίβο, η β-φουρκέτα, αποτελούμενο από εξαιρετικά υδρόφοβα αμινοξικά κατάλοιπα, ανακαλύφθηκε και, κατά συνέπεια, αυτό είναι πιθανώς το μιτοχονδριακό σήμα στόχευσης για τα διαμεμβρανικά β-βαρέλια (Jores et al., 2016). O βασικός σκοπός αυτής της εργασίας είναι η περιεκτική υπολογιστική μελέτη των χαρακτηριστικών σε επίπεδο αμινοξικής ακολουθίας όλων των βOMPs με στόχο την αποκάλυψη βασικών χαρακτηριστικών που οδηγούν στον λειτουργικό χαρακτηρισμό και την ταξινόμησή τους. Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται κυρίως στους ακόλουθους τρεις στόχους: Ο πρώτος μας στόχος είναι να χαρακτηρίσουμε πλήρως τις οικογένειες των μιτοχονδριακών και χλωροπλαστικών βΟΜΡ, που είναι ήδη γνωστές στη βιβλιογραφία (δηλαδή, υπάρχουν πειραματικά δεδομένα για τον εντοπισμό και τη λειτουργία των πρωτεϊνών), αλλά δεν έχουν μέχρι σήμερα μελετηθεί και χαρακτηριστεί με υπολογιστικές μεθόδους. Η βάση δεδομένων PFAM (El-Gebali et al., 2019), η πληρέστερη βάση δεδομένων οικογενειών πρωτεϊνών, περιλαμβάνει μόνο λίγες χαρακτηριστικά προφίλ για αυτές τις οικογένειες. Για το σκοπό αυτό, εμείς: 1. Πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη αναζήτηση της βιβλιογραφίας για όλα τα ευκαρυωτικά διαμεμβρανικά βΟΜΡ. 2. Πραγματοποιήσαμε μια υπολογιστική ανάλυση όλων των ευκαρυωτικών διαμεμβρανικών βΟΜΡ και μελετήσαμε τα χαρακτηριστικά των αμινοξικών ακολουθιών τους. 3. Χωρίσαμε την οικογένεια ευκαρυωτικών πορινών (PFAM: PF01459) σε δύο διαφορετικές οικογένειες βOMP: τα εξαρτώμενα από την τάση κανάλια ανιόντων (VDAC) και τις τρανσλοκάσες της εξωτερικής μεμβράνης του μιτοχονδρίου 40 (TOM40). Παρόλο που αυτές οι δύο οικογένειες παρουσιάζουν υψηλή ποικιλομορφία σε επίπεδο αμινοξικής ακολουθίας (Cavalier-Smith, 2006; Maćašev et al., 2004; Paschen et al., 2003), κατατάσσονται στην ίδια οικογένεια στην PFAM (El-Gebali et al., 2019). 4. Μελετήσαμε τη συχνότητα εμφάνισης όλων των ευκαρυωτικών διαμεμβρανικών οικογενειών βΟΜΡ στα πρωτεώματα ευκαρυωτικών οργανισμών-μοντέλων και αποδόσαμε νέο λειτουργικό σχολιασμό για πολλές προηγουμένως μη χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες. Ο δεύτερος στόχος μας είναι η OMPdb (Tsirigos et al., 2011), μια βάση δεδομένων για βακτηριακά βΟΜΡ, να γίνει ένας ενιαίος κόμβος για όλα τα διαμεμβρανικά βΟΜΡ, ευκαρυωτικά και προκαρυωτικά. Από το 2011, η OMPdb λειτούργησε ως αποθετήριο για τα βακτηριακά βΟΜΡ και είναι μέχρι τώρα η πιο πλήρης συλλογή διαμεμβρανικών βΟΜΡ των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων. Ενημερώνεται διαρκώς χρησιμοποιώντας μια συλλογή χαρακτηριστικών προφίλ Hidden Markov Models (pHMMs) (Tsirigos et al., 2011). Εδώ κάναμε τα εξής: 1. Προσθέσαμε νέες οικογένειες και ενημερώσαμε τις υπάρχουσες είτε συμπεριλαμβάνοντας νέο λειτουργικό σχολιασμό ή ενημερώνοντας τα αντίστοιχα pHMMs. 2. Συμπεριλάβαμε νέες δυνατότητες, όπως η δημιουργία τρισδιάστατων μοντέλων για όλα τα μέλη του αρχικού συνόλου (seed set) κάθε οικογένειας, η πλήρης τοπολογία κάθε πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας τους αλγόριθμους πρόγνωσης SignalP5 και PREDTMBB2 και, τέλος, ο επανασχεδιασμός του περιβάλλοντος εργασίας χρήστη (user interface). Ο τρίτος στόχος μας είναι να μελετήσουμε τα χαρακτηριστικά των δύο τελευταίων β-φύλλων των μιτοχονδριακών βΟΜΡs και να δοκιμάσουμε για να κατασκευάσουμε μια υπολογιστική μέθοδο βασισμένη σε κρυφά μοντέλα Markov για την αναγνώριση όλων των μιτοχονδριακών διαμεμβρανικών βΟΜΡ. Για να διερευνήσουμε αυτά τα χαρακτηριστικά, ακολουθήσαμε τα εξής βήματα: 1. Προσπαθήσαμε να δημιουργήσουμε ένα ειδικό pHMM με βάση τα τελευταία δύο β-φύλλα των μιτοχονδριακών βΟΜΡs. 2. Πραγματοποιήσαμε πολλαπλές αναζητήσεις χρησιμοποιώντας αυτό το pHMM σε θετικά και αρνητικά σύνολα ώστε να αξιολογήσουμε την ικανότητά του να ανιχνεύει όλα τα μιτοχονδριακά βΟΜΡ και να τα ξεχωρίζει από τα αντίστοιχα σφαιρικά-υδατοδιαλυτά, χλωροπλαστικά ή/και βακτηριακά β-βαρέλια.