Διερεύνηση μηχανισμών ανάπτυξης καρδιαγγειακών νόσων χρησιμοποιώντας το πειραματόζωο Danio rerio (zebrafish)

Abstract

The zebrafish (Danio rerio), as an experimental vertebrate embryonic model, has been utilized in the past few years in cardiovascular research since it offers a series of advantages over other animal models. Thus, the zebrafish genome is highly homologous to the human one, has a relative simple heart anatomy (two chambers) and endocardial circulation and the embryos are transparent allowing live tracking of the cardiovascular system development under the microscope. In addition, the myocardial tissue exhibits extensive regenerative capacity even in the adult stage, and investigators have developed a plethora of applications using genetic tools in their studies. In this study we aim to further investigate the potential regeneration ability of cardiac valves in embryonic and adult zebrafish models. These models express the bacterial nitroreductase gene in the cardiac valves with the use of Gal4/UAS activating system at the cardiac valves. By applying the prodrug metronidazole to these models we were able to cause chemogenetic ablation of the valve’s endothelial and mesenchymal cells. In embryos, where the drug was washed off, we observed the regeneration of the atrioventricular and arterial valve after 8 days. Similar results were observed in adult Gal4/UAS models as well (within 15 days). This process seems to be regulated by the Notch signalling pathway, since its chemical inhibition eliminated the regeneration potential of the valves. Additionally, zebrafish is used as an experimental model for large scale chemical genetic screens in vivo, due to the large number of transparent embryos that can be obtained. In the herein presented doctoral research, we developed an experimental procedure for the identification of new chemical molecules – potential inhibitors of angiogenesis – through in vivo phenotypic analysis of zebrafish transgenic embryos. These new molecules are thiophene analogues, which exhibit optimized antiangiogenic activity through the VEGFR2 signalling pathway.

Το zebrafish (Danio rerio) έχει εισαχθεί τα τελευταία χρόνια στην έρευνα του καρδιαγγειακού συστήματος και εμφανίζει μια σειρά από πλεονεκτήματα. Συγκεκριμένα, το γονιδίωμά του εμφανίζει υψηλή ομολογία με το ανθρώπινο, έχει σχετικά απλή καρδιακή ανατομία (δίχωρη καρδιά) και ενδοκαρδιακή κυκλοφορία, ενώ τα έμβρυα που λαμβάνονται είναι διάφανα, γεγονός που επιτρέπει τη μη επεμβατική παρακολούθηση της ανάπτυξης του καρδιαγγειακού συστήματος με μικροσκοπία. Επιπροσθέτως, ο μυοκαρδιακός ιστός εμφανίζει εκτεταμένη αναγεννητική ικανότητα, ακόμα και σε ενήλικα στάδια, ενώ παράλληλα έχει αναπτυχθεί μία πληθώρα γενετικών εργαλείων από ερευνητικές ομάδες που το χρησιμοποιούν ως μοντέλο στις μελέτες τους. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της δυνατότητας αναγέννησης των καρδιακών βαλβίδων σε εμβρυικά και ενήλικα διαγονιδιακά μοντέλα zebrafish. Τα μοντέλα αυτά εκφράζουν τη βακτηριακή νιτρορεδουκτάση μέσω του συστήματος Gal4/UAS στις καρδιακές βαλβίδες. Με τη βοήθεια του προφαρμάκου μετρονιδαζόλη επιτυγχάνεται απώλεια των ενδοθηλιακών και μεσεγχυματικών βαλβιδικών κυττάρων. Σε έμβρυα που εκπλύθηκαν από τη μετρονιδαζόλη παρατηρήθηκε, μετά από 8 ημέρες, αναγέννηση της κολποκοιλιακής και αρτηριακής βαλβίδας. Αντίστοιχα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και σε πειράματα αναγέννησης ενήλικων καρδιών διαγονιδιακών ατόμων Gal4/UAS (εντός 15 ημερών). Η όλη διαδικασία φαίνεται να εμπίπτει σε ρύθμιση από το μοριακό μονοπάτι Notch, αφού χημική αναστολή του έδειξε μειωμένη αναγεννητική ικανότητα. Επιπροσθέτως, το zebrafish, λόγω του μεγάλου αριθμού διάφανων εμβρύων που μπορούν να ληφθούν μέσω εξωτερικής γονιμοποίησης, χρησιμεύει ως ένα ιδανικό πειραματικό μοντέλο σε ευρείας κλίμακας in vivo μελέτες χημικού γενετικού ελέγχου. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, αναπτύσσεται ένα παράδειγμα ταυτοποίησης νέων χημικών μορίων - αναστολέων της αγγειογένεσης με in vivo φαινοτυπική ανάλυση διαγονιδιακών εμβρύων zebrafish. Τα νέα αυτά μόρια αποτελούν ανάλογα του θειοφαινίου, με στόχο τη βελτιστοποίηση της αντιαγγειογενετικής δράσης μέσω του VEGFR2 σηματοδοτικού μονοπατιού.