Μελέτη μεθυλίωσης του DNA σε παιδιά και εφήβους με αυτοάνοσα νοσήματα του θυρεοειδούς αδένα

Abstract

Introduction: Hashimoto Thyroiditis (HT) and Graves' Disease (GD) are conditions known to be caused by abnormal immune response against self-antigens. Biological processes at molecular lever are still poorly understood. A few epigenetic studies have been published so far. Objective: To investigate whether there are differences in DNA methylation within the promoters of HLADRB1, CD40L, FOXP3, CTLA4, FCRL3, IL2RA and PTPN22 genes between young patients with autoimmune thyroid disease and healthy individuals of similar age, sex and body mass index. Additionally, to explore whether there are factors from personal, family, obstetric, perinatal history as well as clinical and laboratory measurements, or other demographic and socioeconomic factors, that are significant determinants of DNA methylation at the genetic sites tested. Patients and Methods: 60 patients with HT (11.7±0.3 years), 10 with GD (12.1±0.4 years), 25 with concurrent diagnosis of Τype 1 Diabetes and Hashimoto Thyroiditis (T1DM+HT) (12.3±0.4 years), and 55 healthy controls (11.1±0.3 years) without any personal or family history of autoimmune disease, at least at first-grade relatives, were recruited. DNA was extracted from whole blood and then modified with sodium bisulfite. The percentage of DNA methylation within the above mentioned gene promoters was quantified, using specific primers for modified DNA, by analyzing melting curves obtained during real-time PCR. Results: Differences in DNA methylation percentages among study groups were detected within the promoters of IL2RA (HT: 36.3±1.4%, T1DM+HT: 35.3±2.2%, GD: 26.0±3.8%, controls: 41.3±1.5%, p<0.001), ΡΤΡΝ22 (HT: 39.9±3.1%, T1DM+HT: 20.3±2.4%, GD: 32.6±7.8%, controls: 27.1±2.4%, p<0.001), CTLA4 (HT: 42.4±3.0%, T1DM+HT: 71.4±4.7%, GD: 45.2±6.7%, controls: 42.3±3.7%, p<0.001) and FOXP3 (HT: 90.1±1.4%, T1DM+HT: 97.3±1.0%, GD: 86.2±5.4%, controls: 93.2±1.1%, p=0.004) but not HLADRB1 (HT: 82.7±2.2%, T1DM+HT: 74.9±3.9%, GD: 88.1±4.5%, controls: 85.2±2.3%), CD40L (HT: 67.5±3.4%, T1DM+HT: 65.9±6.0%, GD: 62.6±6.0%, controls: 60.5±3.8%) or FCRL3 (HT: 77.1±2.1%, T1DM+HT: 76.6±2.8%, GD: 85.0±3.1%, controls: 76.8±1.8%) (p>0.05 in all cases). Moreover, factors that were found to be independently associated with DNA methylation within the promoters of the tested genes were sex (CD40L), the presence of another autoimmune disease (CTLA4, FOXP3, PTPN22), diagnosis of autoimmune thyroid disease (IL2RA), impaired thyroid function (FCRL3), the presence of goiter (PTPN22), as well as other factors such as father's educational level (CTLA), maternal smoking during pregnancy (FCRL3), gestational diabetes (FOXP3) and body mass index z-score (CD40L, FCRL3) (adjusted p≤0.05 in all cases). Conclusions: This study suggests that altered DNA methylation in different gene promoters does exist in patients with autoimmune thyroid disease. Factors that are significant determinants of DNA methylation are also described. These differences remain to be shown whether they are related with variability in the expression of the corresponding genes, thus shedding light in the aetiopathogenesis of autoimmune thyroid disease in childhood and adolescence.

Εισαγωγή: Η θυρεοειδίτιδα Hashimoto (ΗΤ) και η νόσος Graves (GD) είναι καταστάσεις που προκαλούνται από διαταραγμένη ανοσιακή απάντηση έναντι αυτο-αντιγόνων. Ωστόσο, οι βιολογικές διεργασίες σε μοριακό επίπεδο εξακολουθούν να είναι ελάχιστα κατανοητές. Λίγες μελέτες επιγενετικής έχουν δημοσιευθεί μέχρι σήμερα.Σκοπός: Να διερευνηθεί αν υπάρχουν διαφορές ως προς τη μεθυλίωση του DNA των υποκινητών των γονιδίων HLADRB1, CD40L, FOXP3, CTLA4, FCRL3, IL2RA και PTPN22 μεταξύ νεαρών ασθενών με αυτοάνοση θυρεοειδική νόσο και υγιών ατόμων ίδιας ηλικίας, φύλου και δείκτη μάζας σώματος. Επίσης να ελεγθεί αν υπάρχουν παράγοντες από το ατομικό, κληρονομικό, μαιευτικό, περιγεννητικό ιστορικό αλλά και κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους ή δημογραφικούς και κοινωνικοοικονομικούς παράγοντες, που αποτελούν σημαντικούς καθοριστές της μεθυλίωσης του DNA στους ελεγχθέντες γενετικούς τόπους. Ασθενείς και μέθοδοι: Μελετήθηκαν 60 ασθενείς με ΗΤ (ηλικίας 11,7±0,3 έτη), 10 με GD (12,1±0,4 έτη), 25 με ταυτόχρονη διάγνωση σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1 και θυρεοειδίτιδας Hashimoto (T1DM+ΗΤ) (12,3±0,4 έτη) και 55 υγιή άτομα (11,1±0,3 έτη) χωρίς ατομικό ή οικογενειακό ιστορικό αυτοάνοσης νόσου τουλάχιστον στους πρώτου βαθμού συγγενείς. Το DNA απομονώθηκε από ολικό αίμα και στη συνέχεια τροποποιήθηκε με διθειώδες νάτριο. Το ποσοστό μεθυλίωσης του DNA στους υποκινητές των προαναφερθέντων γονιδίων ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για τροποποιημένο DΝΑ και αναλύοντας τις καμπύλες αποδιάταξης του DNA που ελήφθησαν κατά τη διάρκεια πειραμάτων PCR πραγματικoύ χρόνου. Αποτελέσματα: Διαφορές στα ποσοστά μεθυλίωσης του DNA μεταξύ των ομάδων διαπιστώθηκαν στους υποκινητές των γονιδίων IL2RA (HT: 36,3±1,4%, T1DM+HT: 35,3±2,2%, GD: 26,0±3,8%, ομάδα ελέγχου: 41,3±1,5%, p<0,001), ΡΤΡΝ22 (HT: 39,9±3,1% , T1DM+HT: 20,3±2,4%, GD: 32,6±7,8%, ομάδα ελέγχου: 27,1±2,4%, p<0,001), CTLA4 (HT: 42,4±3,0%, T1DM+HT: 71,4±4,7%, GD: 45,2±6,7%, ομάδα ελέγχου: 42,3±3,7%, p<0,001) και FOXP3 (HT: 90,1±1,4%, T1DM+HT: 97,3±1,0%, GD: 86,2±5,4%, ομάδα ελέγχου: 93,2±1,1%, p=0,004) αλλά όχι των HLADRB1 (HT: 82,7±2,2%, T1DM+HT: 74,9±3,9%, GD: 88,1±4,5%, ομάδα ελέγχου: 85,2±2,3%), CD40L (HT: 67,5±3,4%, T1DM+HT: 65,9±6,0%, GD: 62,6±6,0%, ομάδα ελέγχου: 60,5±3,8%) και FCRL3 (HT: 77,1±2,1%, T1DM+HT: 76,6±2,8%, GD: 85,0±3,1%, ομάδα ελέγχου: 76,8±1,8%) (p>0,05 σε όλες τις περιπτώσεις). Επιπλέον, μεταξύ των παραγόντων που βρέθηκαν να συσχετίζονται ανεξάρτητα με τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA συγκαταλλέχτηκαν το φύλο (CD40L), η ύπαρξη και άλλου αυτοάνοσου νοσήματος (CTLA4, FOXP3, PTPN22), η διάγνωση αυτοάνοσης θυρεοειδικής νόσου (IL2RA), η διαταραγμένη θυρεοειδική λειτουργία (FCRL3), η παρουσία βρογχοκήλης (PTPN22), αλλά και άλλοι παράγοντες όπως το μορφωτικό επίπεδο του πατέρα (CTLA4), το κάπνισμα της μητέρας στην κύηση (FCRL3), ο διαβήτης κύησης (FOXP3) και η τιμή z του δείκτη μάζας σώματος (CD40L, FCRL3) (προσαρμοσμένο p≤0,05 σε όλες τις περιπτώσεις). Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη υποδηλώνει ότι πράγματι υπάρχουν διαφορές στα ποσοστά μεθυλίωσης του DNA σε διαφορετικούς υποκινητές γονιδίων σε ασθενείς με αυτοάνοση θυρεοειδική νόσο. Επίσης αναγνωρίστηκαν παράγοντες που αποτελούν κύριους καθοριστές των επιπέδων μεθυλίωσης του DNA. Αυτές οι διαφορές μένει να διευκρινιστεί αν σχετίζονται με διαφορές της έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων, ρίχνωντας έτσι περαιτέρω φως στην αιτιοπαθογένεια της αυτοάνοσης θυρεοειδικής νόσου κατά την παιδική ηλικία και την εφηβεία.