Discrimination of cancer cells and tissues by applying advanced non-linear microscopy techniques

Abstract

The aim of this thesis was to develop advanced new microscopic non-invasive techniques as novel diagnostic tools for cancer research. The past decades have seen the rapid development of imaging techniques that limited in visualizing the vasculature and organ structures. Until now the observation in cellular level requires tissue isolation and appropriate treatment for immunohistochemical, protein or molecular analysis. Non-linear microscopy offers non-invasive visualization in subcellular level, without the need for any preparation of the samples e.g. fixation or staining. The main objective of this dissertation is the discrimination of cancer cells and tissues by developing non-destructive, label-free microscope techniques. First, quantitative discrimination of the different subtypes of human breast cancer cell lines was achieved as compared to peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) based on their lipid content. These results combined with Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopy and provided additional valuable chemical information on breast cancer cells, correlating Third Harmonic Generation (THG) signal to lipid rafts. Furthermore, non-linear microscopy techniques were used as novel digital pathology methods in human breast cancer tissues. It was shown that the quantification of THG signals can differentiate malignant from normal breast tissue samples and distinguish the different grades of cancer. This study has significant clinical potential since it can monitor quantitative changes in cellular behavior in healthy and pathological human tissues. Finally, the detection of mouse T cells activation achieved by using THG imaging in an attempt to follow the immune response development. THG signal was correlated with Raman Spectroscopy and implemented during T cell activation in the presence of a higher concentration of cholesterol and lipids.This essay provided an important opportunity to advance the understanding of cancer research by utilizing non-invasive innovative spectroscopic modalities. Both qualitative and quantitative approaches were employed in these investigations in case of cancer diagnosis and immunotherapy. The findings of this thesis revealed that non-linear microscopy techniques could be used as promising tools in the future for the determination of cancer limits at a subcellular level during the surgery.

Στο πλαίσιο της διδακτορικής διατριβής αναπτύχθηκε μια νέα διαγνωστική/ απεικονιστική μη παρεμβατική τεχνική για την επίτευξη διαχωρισμού μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων . Η διακριτική ικανότητα των μέχρι σήμερα χρησιμοποιούμενων απεικονιστικών τεχνικών in vivo περιορίζεται στο επίπεδο του οργάνου και της αγγείωσης αυτού χωρίς να μπορεί να διεισδύσει σε κυτταρικό επίπεδο. Η όποια μελέτη σε επίπεδο κυττάρου επιβάλλει την απομόνωση του ιστού και την κατάλληλη επεξεργασία για ανοσοϊστοχημική, πρωτεϊνική ή μοριακή ανάλυση. Η μη γραμμική μικροσκοπία παρέχει μια μη παρεμβατική απεικόνιση των υποκυττάριων δομών. Επιπλέον δεν υπάρχει αναγκαιότητα μονιμοποίησης ή χρώσης του κυττάρου. Στη παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκαν απεικονιστικές μετρήσεις σε μη σημασμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές, αντιπροσωπευτικές τριών διαφορετικών υποτύπων καρκίνου μαστού για να ταυτοποιηθεί το προφίλ του μη γραμμικού σήματος Γένεσης Τρίτης Αρμονικής (THG) συχνότητας από τα υπό ακτινοβόληση δείγματα (Κεφάλαιο 5). Παρατηρήθηκε ότι με τη χρήση THG απεικόνισης ως καινοτόμου διαγνωστικού εργαλείου μπορεί να γίνει κατηγοριοποίηση των διαφόρων υποτύπων των καρκινικών σειρών με βάση τη ποσότητα των ενδοκυττάριων λιπιδικών εναποθέσεων ανά επιφάνεια κυττάρου. Παράλληλα έγινε έλεγχος του προφίλ της THG απεικόνισης σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) φυσιολογικών αιμοδοτών έτσι ώστε να γίνει σύγκριση και διαφοροποίηση των καρκινικών σειρών από τα φυσιολογικά κύτταρα. Για τη διάκριση των φυσιολογικών κυττάρων από τα καρκινικά χρησιμοποιήθηκε ένας αλγόριθμος (MATLAB) βασισμένος στα συλλεγόμενα σήματα THG . Πιο συγκεκριμένα ο αλγόριθμος αυτός μελετά την κατανομή, το μέγεθος και τη σύσταση των ενδοκυττάριων λιπιδικών σωματίων με στόχο να γίνει η διάκριση των φυσιολογικών κυττάρων του περιφερικού αίματος από τα καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι με τη μέθοδο της THG μπορεί να γίνει στατιστικά σημαντική διάκριση και σαφής διαχωρισμός των διαφόρων υποτύπων των καρκινικών σειρών από τα φυσιολογικά κύτταρα ως προς την ποσότητα των ενδοκυττάριων λιπιδικών εναποθέσεων. Στη συνέχεια διεξήχθησαν βιοχημικές μετρήσεις με τη μέθοδο φασματοσκοπίας υπερύθρου FTIR με στόχο τη συσχέτιση και επεξήγηση των αποτελεσμάτων της ποσοτικοποίησης του συλλεγόμενου σήματος της τρίτης αρμονικής με βιοχημικές πληροφορίες. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι υπάρχουν χημικές αλλαγές στις λιπιδικές εναποθέσεις που συμβάλουν στη διαφοροποίηση μεταξύ καρκινικών σειρών σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα το υψηλότερο σήμα της τρίτης αρμονικής συσχετίστηκε με τις λιπιδικές σχεδίες (lipid rafts) στις κυτταρικές μεμβράνες λόγω της αυξημένης συγκέντρωσης της χοληστερόλης. Η εφαρμογή της προτεινόμενης έρευνας θα οδηγήσει στην ανάπτυξη νέας τεχνολογίας όπου ο συνδυασμός της μη-γραμμικής μικροσκοπίας με άλλες τεχνικές θα μπορεί να οδηγεί στο διαχωρισμό των καρκινικών κυττάρων έναντι των φυσιολογικών στην περίπτωση καρκινικών κυκλοφορόντων κυττάρων (CTCs). Στην συνέχεια χρησιμοποιώντας την αποκτηθείσα γνώση και εμπειρία, έγινε προσπάθεια διάκρισης ενεργοποιημένων και μη Τ λεμφοκυττάρων από σπλήνα ποντικού και ποσοτικοποίηση των διάφορων σταδίων ενεργοποίησης τους μέσω της καταγραφής του σήματος THG (Κεφάλαιο 7) . Πιο συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν δυο διαφορετικοί τρόποι ενεργοποίησης με την χρήση της μιτογόνου ουσίας concanavalin-A; (ConA) και του ειδικού αντιγόνου human serum albumin; (HSA) για την παρακολούθηση τους στο μη γραμμικό μικροσκόπιο. Οι ποιοτικές και ποσοτικές αναλύσεις μέσω της THG έδειξαν στατιστικά σημαντική αλλαγή στον αριθμό των ενδοκυττάριων λιπιδικών εναποθέσεων κατά την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων σε σχέση με τα μη ενεργοποιημένα κύτταρα. Επιπλέον για την συσχέτιση του σήματος της τρίτης αρμονικής με χημική πληροφορία πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις φασματοσκοπίας Raman και απέδειξαν σημαντικές αλλαγές στους διαφορετικούς τρόπους ενεργοποίησης καθώς και στην συσχέτιση με τα μη ενεργοποιημένα κύτταρα. Ειδικά η ανάλυση με γραμμική προσαρμογή (linear fitting) έδειξε υψηλή συσχέτιση του σήματος τρίτης αρμονικής με δεσμούς λιπιδικών εναποθέσεων, χοληστερόλης όμως όχι τριγλυκεριδίων . Η μελέτη αυτή αναμένεται να προσφέρει σημαντικές καινοτόμες πληροφορίες για τις βιολογικές διεργασίες των Τ λεμφοκυττάρων, ενώ ταυτόχρονα θα μπορεί να προσφέρει τον άμεσο εντοπισμό των ενεργοποιημένων κυττάρων στη διαγνωστική της ανοσοθεραπείας.Παράλληλα, χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία της μη γραμμικής μικροσκοπίας στη μελέτη καρκινικών και φυσιολογικών ιστών μαστού (Κεφάλαιο 6). Ειδικότερα, χρησιμοποιήθηκαν τα μη γραμμικά φαινόμενα γένεσης δεύτερης αρμονικής (SHG) για την παρακολούθηση της κατανομής του κολλαγόνου και τρίτης αρμονικής (THG) για την αποκάλυψη λιπιδικών εναποθέσεων, ανομοιογενειών και διεπιφανειών στον ιστό. Οι ιστοί που μελετήθηκαν είναι από φυσιολογικούς μάρτυρες (control) και από ασθενείς σε διαφορετικό στάδιο ανάπτυξης του καρκίνου (grade I-III) . Τα πειραματικά αποτελέσματα από την ποσοτική ανάλυση μέσω τρίτης αρμονικής είναι ιδιαιτέρως ενθαρρυντικά και έδειξαν ότι μπορεί να γίνει διάκριση των καρκινικών κυττάρων στον ιστό βασιζόμενη στις μεμβράνες και στις λιπιδικές εναποθέσεις και η διαφοροποίησή τους από τα φυσιολογικά κύτταρα. Παράλληλα επιτεύχθηκε διαχωρισμός των διάφορων σταδίων (grade I-III) του καρκινικού ιστού μαστού βασιζόμενο στις λιπιδικές εναποθέσεις και τις ανομοιογένειες . Συμπληρωματικά, βασιζόμενοι στα εξαγόμενα μορφολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων, χωρίς την χρήση καμίας χρώσης μόνο με την συλλογή των μη γραμμικών σημάτων, υπολογίστηκε ο λόγος της επιφάνειας του πυρήνα προς την επιφάνεια του κυτταροπλάσματος που είναι ένας από τους ευρέως γνωστούς τρόπους διάγνωσης καρκινικών ιστών από τους παθολογοανατόμους. Επιπλέον, μέσω της συλλογής των μη γραμμικών σημάτων (ένταση, αριθμός λιπιδικών εναποθέσεων και όγκος κυττάρου) έγινε διάκριση των καρκινικών κυττάρων στην περιοχή σάρωσης και εκτίμηση του ποσοστού των καρκινικών κυττάρων στον ιστό. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη φασματοσκοπίας FTIR στους ιστούς για την συσχέτιση των μη γραμμικών σημάτων με βιοχημική πληροφορία. Η συσχέτιση αυτή υπέδειξε ότι βασιζόμενοι σε συγκεκριμένους λιπιδικούς δεσμούς μπορεί να υπάρξει συσχέτιση του μη γραμμικού σήματος της Τρίτης αρμονικής με τα λιπίδια και να επιτευχθεί η διάκριση του καρκινικού από το φυσιολογικό ιστό. Στο τελευταίο μέρος της διατριβής, έγινε προσπάθεια σάρωσης μεγαλύτερης επιφάνειας του ιστού (σε επίπεδο χιλιοστού) μέσω της μη γραμμικής μικροσκοπίας. Η σημαντικότητα της έρευνας αυτής είναι ότι η χρήση μη γραμμικών απεικονιστικών μετρήσεων χωρίς κάποια ιδιαίτερη προετοιμασία του δείγματος ή την χρήση σημάνσεων (markers) στον ιστό, προσφέρει τη δυνατότητα διαχωρισμού των φυσιολογικών από τους καρκινικούς ιστούς, σε αντίθεση με τις έως τώρα μοριακές μεθόδους που χρησιμοποιούνται στις κλινικές. Η μέθοδος της μη γραμμικής μικροσκοπίας προτείνεται ως ένα νέο καινοτόμο διαγνωστικό εργαλείο που θα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο των υγιών ορίων σε επίπεδο κυττάρου κατά την διάρκεια επέμβασης.