Design and application of bioactive nanoparticles in cancer prevention and therapy

Abstract

Colorectal cancer is considered a major worldwide health problem with high prevalence and mortality rates. Unfortunately, the scientific progress in the last twenty years has not yet been fully translated into achievements in the clinical practice. Thus, innovative approaches need to be developed and evaluated for utilization of research findings in cancer management. Nanoparticles, a versatile class of materials, represent an effective tool that can be harnessed, facilitating the development of novel biomedical applications in cancer research. Magnetic nanoparticles in particular, have emerged as an important type of functional structures enabling the development of state-of-the art scientific methods due to their ability to be externally controlled. On the other hand, biogenic nanoparticles comprise a different type of nanomaterials that can be synthesized and produced in biological systems. Thus, compared to chemically synthesized nanoparticles, they are more bioavailable, eco-friendly and cost-effective to produce, but, most importantly, biogenic nanoparticles are less toxic. In this dissertation, we employed magnetic nanoparticles with a hydronamic diameter of 100 nm, consisting of a Fe3O4 core coated by a biocompatible starch layer, in order to improve and optimize the transplantable mouse tumor model for the in vivo evaluation of novel anticancer therapeutic strategies. The optimized protocol is based on MNPs-tagged implanted cancer cells that are magnetically manipulated, in order to enable a restricted local growth of tumor cells with the aim to confine the inter-animal variability in tumor volume. Magnetic nanoparticles were employed in order to render CT26 colon cancer cells magnetically responsive before their subcutaneous injection in BALB/c mice. A small magnet was attached on the injection site for the manipulation of the migration pattern of the implanted cells towards localized tumor formation. The in vivo proof-of-principle study was designed to utilize a low-dose of Fluorouracil (5-FU) as a representative anticancer therapy. Although the 5-FU-induced tumor growth inhibition was statistically insignificant in the ‘Control’ group, a statistically significant difference was detected in the ‘Nanoparticles’ group. Remarkably, 60% fewer animals were needed to obtain highly reproducible results when applying the proposed protocol. Furthermore, in colon cancer cells we investigated the growth inhibitory effects of magnetomechanical stress induced by magnetic field-actuated magnetic nanoparticles, employing the same type of biocompatible Fe3O4 nanoparticles as in the previous study. Both static and alternating low frequency magnetic fields with varying intensity (40–200 mT), frequency (0–8 Hz) and field gradient were comparatively studied. Our findings indicate that not only intensity and gradient but also frequency as well as mode of magnetic field affect cellular processes that regulate cell growth. Noteworthy, the optimal static magnetic field of the strongest intensity and gradient (200 mT) that exerted the strongest maximum forces inside cells (29 pN) via the actuation of the internalized nanoparticles, was the field that induced maximum cell growth inhibition. Growth inhibition was not attributed to thermal effects or to cell death but G2/M cell cycle arrest was involved. Moreover, the optimal treatment conditions induced the protein expression of the cell cycle regulators Cyclin B1 and Cyclin D1. Interestingly, internalized nanoparticles were found to preferentially accumulate in the lysosomes, as correlation analysis suggests, and, upon actuation, a significantly reduced number of lysosomes per cell was detected. Finally, we produced biogenic dietary selenium nanoparticles that exhibited excellent cancer-specific antiproliferative properties against colon cancer in vitro as well as significant tumor growth suppression in vivo. The probiotic strain Lactobacillus casei ATCC 393 was utilized to synthesize nanoparticles, which i) contain amorphous selenium, ii) are of spherical shape and iii) have a mean diameter of 360 nm. Our findings suggest that, in contrast to L. casei, purified SeNps or SeNps-enriched L. casei exhibited cancer-specific antiproliferative activities against colon cancer cells. Specifically, SeNps induced G1/G0 cell cycle arrest in both CT26 and HT29 cells. Moreover, in HT29 cells, SeNps pronouncedly upregulated the expression of certain pro-apoptotic proteins, such as TNFR1, Bax and the TRAIL death receptors DR4 and DR5, while they inhibited the expression of various apoptosis inhibitors, such as Survivin, Livin, cIAP1 and cIPA2. Crucially, orally administered SeNps-enriched L. casei generated the strongest tumor growth suppression (-77% reduction in tumor volume) compared to wild-type L. casei or SeNps: the latter two induced similar rates of tumor growth inhibition (-54% and -48%, respectively) in the experimental CT26 mouse tumor model. Future investigations may further characterize the underlying molecular mechanisms and broaden the application spectrum of the proposed novel protocols and procedures. Τhe applicability of the described nanoparticle-based scientific work in these different cancer research areas though, demonstrates the potential of cancer biotechnology to harness nanoparticles and revolutionize the field.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου εμφανίζει υψηλά ποσοστά παγκόσμιου επιπολασμού και θνησιμότητας αποτελώντας ένα σημαντικό πρόβλημα υγείας που απασχολεί εντατικά τη διεθνή επιστημονική κοινότητα. Υπάρχει η ανάγκη να διερευνηθούν καινοτόμες προσεγγίσεις και να εφαρμοστούν νέες τεχνολογίες για την επιτυχή αξιοποίηση των νέων επιστημονικών δεδομένων στην αντιμετώπιση και καταπολέμηση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα νανοσωματίδια, μια κατηγορία υλικών με ετερογενή χαρακτηριστικά, αποτελούν ένα εξαιρετικό εργαλείο για την ανάπτυξη καινοτόμων ιατροβιοτεχνολογικών εφαρμογών. Λόγω της νανοκλίμακας, τα νανοσωματίδια εμφανίζουν νέες ιδιότητες που δεν παρατηρούνται στα υλικά όγκου. Επίσης, κατά τη σύνθεση τους μπορούν να προσχεδιαστούν επιθυμητά χαρακτηριστικά, όπως η σύσταση, το μέγεθος, η μορφολογία και οι χημικές ιδιότητες της επιφάνειας τους. Επομένως, τα νανοσωματίδια, προσφέρουν ένα ευρύ φάσμα αξιοποιήσιμων ιδιοτήτων και συνιστούν ένα πολλά υποσχόμενο ερευνητικό εργαλείο για τη διάγνωση, πρόληψη και θεραπεία του καρκίνου. Στις βιοϊατρικές εφαρμογές, τα μαγνητικά νανοσωματίδια, λόγω των μαγνητικών τους ιδιοτήτων, θεωρούνται ιδιαίτερα ελκυστικά εργαλεία, καθώς υπάρχει η δυνατότητα χειρισμού τους από απόσταση και μπορούν να κατευθύνονται με χρήση εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Αυτή τους η ευελιξία, η οποία συνδυάζεται και με τη διαπερατότητα του ανθρώπινου σώματος στα μαγνητικά πεδία, επιτρέπει την ανάπτυξη καινοτόμων ερευνητικών στρατηγικών και θεραπευτικών μεθόδων. Εναλλακτικά, τα βιογενή νανοσωματίδια, ανήκουν σε μια διαφορετική κατηγορία νανοϋλικών, των οποίων η σύνθεση και η παραγωγή μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσα σε βιολογικά συστήματα. Ο βιογενής τρόπος σύνθεσής τους, ενισχύει τη βιοδιαθεσιμότητα τους ενώ παράλληλα τα καθιστά λιγότερο τοξικά και πιο οικονομικά σε σχέση με τα χημικώς συντεθειμένα νανοσωματίδια. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν μαγνητικά νανοσωματίδια για τη βελτίωση καρκινικού μοντέλου στον ποντικό με σκοπό την προκλινική in vivo εξέταση νέων αντικαρκινικών στρατηγικών. Συγκεκριμένα, η μέθοδος αναπτύχθηκε στο CT26 συνγονικό μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου σε BALB/c ποντικούς. Η προτεινόμενη στρατηγική βασίζεται στην υποδόρια χορήγηση καρκινικών κυττάρων που έχουν προσλάβει μαγνητικά νανοσωματίδια και στον μαγνητικό χειρισμό – εντοπισμό των κυττάρων, με τη βοήθεια ενός μικρού εξωτερικού μαγνήτη. Ο μαγνητικός χειρισμός των κυττάρων, οδηγεί στον περιορισμό της διάχυσης τους στην περιοχή της εμφύτευσης με αποτέλεσμα οι ποντικοί της ομάδας να αναπτύσσουν περισσότερο ομοιογενείς όγκους με μικρότερο εύρος μεγέθους. Η προτεινόμενη εφαρμογή οδήγησε σε σημαντική βελτίωση της ευαισθησίας της μεθόδου και της στατιστικής δύναμης των αποτελεσμάτων.Προκειμένου να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της μεθόδου, χορηγήθηκε ως αντιπροσωπευτική υποψήφια αντικαρκινική θεραπεία ασθενούς δραστικότητας, χαμηλή δόση χημειοθεραπευτικού Φλουορουρακίλη (5-FU) σε μικρές ομάδες ζώων. Η χορήγηση 5-FU προκάλεσε μη στατιστικώς σημαντική μείωση στο μέγεθος των όγκων της ομάδας μάρτυρα ενώ ανιχνεύθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην ομάδα ελέγχου όπου είχε ακολουθηθεί το προτεινόμενο πρωτόκολλο. Επιπλέον, η προτεινόμενη μέθοδος επέτρεψε τη μείωση κατά 60% του απαιτούμενου αριθμού ζώων και τη συλλογή αναπαραγώγιμων αποτελεσμάτων. Τέλος, το πρωτόκολλο μπορεί να εφαρμοστεί ευρέως καθώς είναι ελάχιστα επεμβατικό, πρακτικό και δεν απαιτεί τη χρήση ειδικού εξοπλισμού ή δεξιοτήτων. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας τoν ίδιο τύπο βιοσυμβατών νανοσωματιδίων μαγνητίτη και με τη βοήθεια εξωτερικού μαγνητικού πεδίου, μελετήθηκε η επίδραση της μαγνητο-μηχανικής καταπόνησης σε κολονικά καρκινικά κύτταρα που είχαν προηγουμένως προσλάβει τα συγκεκριμένα μαγνητικά νανοσωματίδια. Στη μελέτη αυτή, εξετάστηκαν στατικά και εναλλασσόμενα μαγνητικά πεδία χαμηλής συχνότητας με μεταβαλλόμενη ένταση (40-200 mT), συχνότητα (0-8 Hz) και βαθμίδα πεδίου ως προς την επίδρασή τους στη βιωσιμότητα και ανάπτυξη των HT29 κολονικών καρκινικών κυττάρων ανθρώπινης προέλευσης. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι όχι μόνο η ένταση και η συχνότητα, αλλά και η βαθμίδα του μαγνητικού πεδίου επηρεάζουν την κυτταρική ανάπτυξη. Αξίζει να σημειωθεί, πως το ισχυρότερο στατικό μαγνητικό πεδίο (200 mT) που εξετάστηκε, το οποίο προκάλεσε την ισχυρότερη μηχανική καταπόνηση εφαρμόζοντας δυνάμεις 29 pN στα κύτταρα, μέσω των προσληφθέντων νανοσωματιδίων, ήταν το πεδίο που προκάλεσε τη μεγαλύτερη αναστολή στην κυτταρική ανάπτυξη. Παρατηρήθηκε, επίσης, ότι η επαγόμενη αυτή αναστολή, δεν μεσολαβείται από θερμικές επιδράσεις ούτε προκαλείται κυτταρικός θάνατος, αλλά διαπιστώθηκε παύση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G2/M και επαγωγή έκφρασης των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου Cyclin B1 και Cyclin D1. Επίσης, παρατηρήθηκε πως τα προσληφθέντα νανοσωματίδια συγκεντρώνονται στα λυσοσώματα των κυττάρων, ενώ παράλληλα μετά την εφαρμογή μαγνητο-μηχανικής καταπόνησης ανιχνεύθηκε σημαντικά μειωμένος αριθμός λυσοσωμάτων ανά κύτταρο.Τέλος, πραγματοποιήθηκε βιογενής σύνθεση νανοσωματιδίων σεληνίου στο προβιοτικό στέλεχος Lactobacillus casei ATCC 393. Η μελέτη χαρακτηρισμού τους έδειξε ότι τα νανοσωματίδια i) αποτελούνται από άμορφο σελήνιο, ii) έχουν σφαιρικό σχήμα, και iii) η μέση διάμετρος τους είναι 360 nm. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι τα απομονωμένα νανοσωματίδια και ο εμπλουτισμένος με νανοσωματίδια L. casei, εμφανίζουν καρκινο-ειδική αντι-πολλαπλασιαστική δράση η οποία συνοδεύεται από ενεργοποίηση κυτταροστατικών και προ-αποπτωτικών μηχανισμών. Συγκεκριμένα, τα νανοσωματίδια σεληνίου προκάλεσαν στα CT26 και HT29 κύτταρα παύση του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1/G0. Επιπλέον, στα HT29 κύτταρα παρατηρήθηκε σημαντική ενίσχυση της έκφρασης συγκεκριμένων προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως των TNFR1, Bax και των υποδοχέων θανάτου DR4 (TRAILR1) και DR5 (TRAILR2), στους οποίους προσδένεται το TRAIL. Παράλληλα, προκλήθηκε μείωση της έκφρασης των αναστολέων της απόπτωσης Survivin, Livin, cIAP1 και cIAP2. Τέλος, η από από του στόματος χορήγηση εμπλουτισμένου με νανοσωματίδια σεληνίου L. casei, οδήγησε σε αξιοσημείωτη μείωση στο μέγεθος CT26 όγκων καρκίνου παχέος εντέρου που αναπτύχθηκαν σε BALB/c ποντικούς (-77% μείωση στο μέσο μέγεθος όγκων σε σχέση με το μάρτυρα) σε σύγκριση με τον απλό L. casei ή τα απομονωμένα νανοσωματίδια σεληνίου που και τα δύο (όταν χορηγήθηκαν ξεχωριστά) προκάλεσαν παρόμοια αναστολή στην ανάπτυξη των όγκων (-54% και -48% αντίστοιχα). Συμπερασματικά, στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται μια διαδικασία βελτίωσης πειραματικού καρκινικού μοντέλου στον ποντικό για την προκλινική αξιολόγηση νέων θεραπευτικών στρατηγικών. Η προτεινόμενη στρατηγική επιτυγχάνει βελτίωση της ευαισθησίας της μεθόδου καθώς και της στατιστικής δύναμης των αποτελεσμάτων, και μείωση του αριθμού απαιτουμένων εργαστηριακών ζώων κατά -60%. Καθώς δύναται να έχει ευρεία εφαρμογή, η προτεινόμενη μέθοδος θα μπορούσε να επιταχύνει τον ρυθμό ανάπτυξης νέων θεραπευτικών στρατηγικών. Επιπλέον, τα αποτελέσματα που περιγράφονται υποδηλώνουν την αναγκαιότητα της μετατόπισης του επιστημονικού ενδιαφέροντος από τη διερεύνηση των βιολογικών επιδράσεων διαφόρων μαγνητικών πεδίων που ενεργοποιούν διάφορους τύπους νανοσωματιδίων, στην εστίαση σε περισσότερο ελεγχόμενες πειραματικές παραμέτρους. Αυτό έχει μεγάλη σημασία για την κατανόηση, τον εντοπισμό και τον έλεγχο, όλων των παραγόντων που επηρεάζουν τις κυτταρικές αποκρίσεις στα μαγνητικά πεδία ή/και στα ενεργοποιημένα μαγνητικά νανοσωματίδια. Συγκεκριμένα, το στατικό μαγνητικό πεδίο έντασης 200 mT που χρησιμοποιήθηκε για την πρόκληση μαγνητο-μηχανικής καταπόνησης μέσω των προσληφθέντων από τα κύτταρα μαγνητικών νανοσωματιδίων, προκάλεσε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού κατά 40%, ενώ δεν παρατηρήθηκε αντίστοιχη αναστολή από τα εναλλασσόμενα πεδία παρόμοιας έντασης που μελετήθηκαν. Τέλος, στη διατριβή αυτή παρουσιάζονται αποτελέσματα που αποδεικνύουν ότι τα νανοσωματίδια σεληνίου που παράγονται από τον L. casei και ο εμπλουτισμένος με νανοσωματίδια σεληνίου L. casei επιδεικνύουν σημαντική αντιπολλαπλασιαστική δράση έναντι του καρκίνου του παχέος εντέρου in vitro, αλλά και in vivo, μετά από από του στόματος χορήγηση. Μελλοντικές έρευνες θα μπορούσαν να συμβάλουν στον περαιτέρω χαρακτηρισμό των επαγόμενων μοριακών μηχανισμών και στη βελτιστοποίηση όλων των περιγραφόμενων πρωτοκόλλων και διαδικασιών. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, που βασίζονται σε καινοτόμες εφαρμογές της χρήσης νανοσωματιδίων, επιδεικνύουν τη δυνατότητα και την προοπτική της νανοβιοτεχνολογίας να φέρει επανάσταση στην έρευνα για την αντιμετώπιση του καρκίνου.