Μηχανισμοί ενεργοποίησης λευκοκυττάρων με ανοσοενισχυτικά πεπτίδια του θύμου αδένα: ανάπτυξη μεθόδου αξιολόγησης της δραστικότητας των πεπτιδίων

Abstract

The aim of this thesis was to investigate the effect of proTα(100-109) and intact prothymosin (proTα) on basic cell functions of innate immunity cells expressing TLR-4 and to develop/evaluate an immunoassay to quantify proTα(100-109) extracellularly, in order to elucidate its mode of action. The activation of neutrophils and monocytes with proTα(100-109) or proTα enhanced their basic functions (phagocytosis, oxidative burst and cytotoxicity) and restored their suppressed functions in breast cancer patients to the levels of healthy individuals. Furthermore, using polyclonal antibodies, we developed a competitive ELISA for proTα(100-109) and determined its concentration in vitro, in supernatants of cells led to cell death, in vivo in the serum of mice infected with bacteria and ex vivo in human sera. Specifically, the levels of proTα(100-109) were higher in apoptotic supernatants compared to low concentrations in the corresponding controls. BALB/c and C57BL/6 mice infected in vivo with five bacterial strains showed differences in the concentration of proTα(100-109) depending on the strain, breeding conditions and the type of pathogen. In general, the levels of proTα(100-109) before infection were low and gradually increased during the progress of infection. Using MALDI-TOF mass spectrometry, we detected a peak corresponding to the molecular mass of the decapeptide only in sera of infected animals. In an aggressive model of lethal sepsis in ICR mice, using Klebsiella pneumoniae that is endocytosed, we observed a gradual increase in the concentration of proTα(100-109), with maximal levels determined at 48 hours postinfection. In animals infected with a standard strain of Klebsiella, we observed variations and activation mainly of necrotic death pathways, as the bacterium was not endocytosed. Finally, we determined the levels of proTα(100-109) in sera of healthy individuals, pediatric patients and patients hospitalized in ICU. ProTα(100-109) levels in healthy subjects were very low, whereas in infected children, we detected higher concentrations of the decapeptide compared to children with autoinflammatory diseases, where the concentration of proTα(100-109) was low. ICU patients’ samples serially collected from admission to exit, showed variable proTα(100-109) concentrations during the hospitalization of patients who developed bacterial infections, which were correlated with clinical symptoms and laboratory markers. In contrast, the concentration of proTα(100-109) was minimal in ICU patients who did not develop an infection. The results of this thesis suggest that proTα(100-109) acts as an adjuvant on neutrophils and monocytes and, eventually could be used as an immunotherapeutic molecule to enhance immune system functions in cancer patients. Moreover, the same molecule could be used as a diagnostic marker for the differential diagnosis between septic and aseptic inflammation, providing that analysis of a larger number of samples from infected patients confirms our results.

Σκοπός της διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης του προΤα(100-109) και της ακέραιης προθυμοσίνης α (προΤα) σε βασικές λειτουργίες κυττάρων της φυσικής ανοσίας που εκφράζουν TLR-4 και η ανάπτυξη/αξιολόγηση ανοσοδοκιμασίας, η οποία να ποσοτικοποιεί το προΤα(100-109) εξωκυτταρικά, ώστε να διαλευκανθεί ο τρόπος δράσης του. Η ενεργοποίηση ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων με προΤα(100-109) ή προΤα ενίσχυσε τις βασικές τους λειτουργίες (φαγοκυττάρωση, οξειδωτική έκρηξη και κυτταροτοξική δράση) και επανέφερε τις κατασταλμένες λειτουργίες τους σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού στα φυσιολογικά επίπεδα των υγιών. Παράλληλα, χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντισώματα, αναπτύξαμε ανταγωνιστική ELISA για το προΤα(100-109), με την οποία προσδιορίστηκε η συγκέντρωση του in vitro, σε υπερκείμενα κυττάρων που οδηγήθηκαν σε κυτταρικό θάνατο, in vivo στον ορό ποντικών μολυσμένων με βακτήρια και ex vivo σε ανθρώπινους ορούς. Ειδικότερα, τα επίπεδα του προΤα(100-109) ήταν αυξημένα σε υπερκείμενα κυττάρων που οδηγήθηκαν in vitro σε απόπτωση, ενώ στα αντίστοιχα υπερκείμενα-μάρτυρες η συγκέντρωσή του ήταν χαμηλή. Σε BALB/c και C57BL/6 ποντίκια, τα οποία μολύνθηκαν in vivo με πέντε βακτηριακά στελέχη, παρατηρήσαμε διαφορές ως προς τη συγκέντρωση του προΤα(100-109) στον ορό ανάλογα με τη φυλή, τις συνθήκες διαβίωσης και το είδος του παθογόνου. Γενικά, τα επίπεδα του προΤα(100-109) πριν τη μόλυνση ήταν χαμηλά και αυξήθηκαν σταδιακά κατά την πρόοδο της λοίμωξης. Με MALDI-TOF φασματομετρία μάζας, ανιχνεύθηκε μικρή κορυφή που αντιστοιχούσε στη μοριακή μάζα του δεκαπεπτιδίου μόνο στους ορούς των μολυσμένων ζώων. Σε επιθετικό μοντέλο θανατηφόρου σηψαιμίας σε ICR ποντίκια με Klebsiella pneumoniae που ενδοκυτταρώνεται, παρατηρήθηκε σταδιακή αύξηση της συγκέντρωσης του προΤα(100-109), με τη μέγιστη ποσότητά του να ανιχνεύεται 48 ώρες μετά τη λοίμωξη. Σε ζώα που μολύνθηκαν με πρότυπο στέλεχος Klebsiella, παρατηρήσαμε αυξομειώσεις και ενεργοποίηση κυρίως νεκρωτικών μονοπατιών θανάτου, λόγω της μη ενδοκυττάρωσης του βακτηρίου. Τέλος, μετρήθηκαν τα επίπεδα του προΤα(100-109) σε ορούς υγιών ατόμων, παιδιατρικών ασθενών και ασθενών της ΜΕΘ. Τα επίπεδα του προΤα(100-109) σε υγιή άτομα ήταν ιδιαίτερα χαμηλά, ενώ στα παιδιά με λοιμώξεις ανιχνεύθηκαν υψηλότερες συγκεντρώσεις δεκαπεπτιδίου σε σχέση με τα παιδιά με αυτοφλεγμονώδη νοσήματα, όπου η συγκέντρωση ήταν χαμηλή. Στα δείγματα της ΜΕΘ, τα οποία ελήφθησαν σειριακά από τη στιγμή της εισαγωγής του ασθενούς μέχρι την έξοδό του, καταγράφηκαν διακυμάνσεις στη συγκέντρωση του προΤα(100-109) κατά την πορεία νοσηλείας ασθενών που εμφάνισαν βακτηριακές λοιμώξεις, οι οποίες συσχετίζονται με την αντίστοιχη κλινική εικόνα και τους εργαστηριακούς δείκτες. Αντίθετα, ελάχιστη ήταν η συγκέντρωσή του σε περιστατικά που νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ χωρίς σημεία λοίμωξης. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, το προΤα(100-109) δρα ανοσοενισχυτικά σε ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα και, ίσως, μελλοντικά θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ανοσοθεραπευτικό μόριο για την ενίσχυση των λειτουργιών του ανοσοποιητικού συστήματος καρκινοπαθών. Παράλληλα, το ίδιο μόριο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό εργαλείο διαφοροδιάγνωσης μεταξύ σηπτικής και άσηπτης φλεγμονής, εφόσον αυτό επιβεβαιωθεί με ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων ασθενών με λοιμώξεις.