Μελέτη ρυθμιστικών μηχανισμών έκφρασης βιομορίων, λειτουργικών ιδιοτήτων και μορφολογικών χαρακτηριστικών των καρκινικών κυττάρων μαστού

Abstract

Estrogen receptors (ERs) have pivotal roles in breast cancer growth and progression. Even though the contribution of ERα in the modulation of breast cancer cells' behavior is thoroughly studied, the biological functions of its isoform, ERβ, are less elucidated. In the present doctoral thesis, we demonstrated that ERβ suppression in the highly aggressive, ERβ-positive MDA-MB-231 breast cancer cells (shERβ MDA-MB-231) resulted in profound phenotypic changes, inhibition of EMT process and major changes in the properties as well as in gene and protein expression levels of certain functional matrix components of breast cancer cells in a 17-β-estradiol (E2)-independent manner. As observed by scanning electron microscopy, ERβ suppression strongly affects the morphology of shERβ MDA-MB-231 cells, which is followed by downregulated expression levels of the mesenchymal markers fibronectin and vimentin, whereas it increases the expression levels of epithelial marker E-cadherin and cell-cell junctions. These alterations are followed by reduced levels of cell functional properties that promote the aggressiveness of these cells, such as proliferation, migration, spreading capacity, invasion and adhesion. Notably, ERβ suppression reduces the migration of MDA-MB-231 breast cancer cells via EGFR/IGF-IR and JAK/STAT signaling pathways. Moreover, our findings revealed that ERβ has a crucial role in modulation of mRNA levels and protein expression of several matrix mediators, including the transmembrane syndecans and intracellular serglycin, several MMPs, plasminogen activation system components and receptor tyrosine kinases. These data clearly demonstrate that ERβ plays a crucial role in mediating cell behavior and ECM composition of the highly aggressive MDA-MB-231 cells and it opens a new area of research to further understand its role and to improve pharmaceutical targeting of the non-hormone-dependent breast cancer.The epigenetic alterations are responsible for the ability of the tumor cells to metastasize. In the present study, we demonstrated that ER status is associated with distinct miRNA expression profiles in MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells, and that mainly miR-10b (oncogenic miRNA) and miR-200b (EMT inhibitor) are the key regulators of MDA-MB-231 cell behavior. Notably, the expression profiles of these miRNAs are mediated through EGFR/IGF-IR crosstalk with E2. Moreover, growing ERα-positive, MCF-7, and ERβ-positive, MDA-MB-231, cells in estrogen-free medium resulted in a diverse impact on miRNA expression and the behavior of these cells, suggesting the specific effect of E2 on the miRNAs expression profile, depending on the ER status of breast cancer cells. Specifically, ERβ suppression in MDA-MB-231 breast cancer cells results in significant changes in the expression profiles of specific miRNAs that regulate breast cancer progression, including miR-10b, miR-200b and miR-145 (tumor-suppressive miRNA). Enhanced miR-10b expression or miR-145 silencing in shERβ MDA-MB-231 cells revealed that these miRNAs can regulate the functional properties, EMT program and expression of major ECM components known as modulators of breast cancer aggressiveness. Our data pinpointed that miR-10b is strongly implicated in the regulation of functional properties, expression of EMT markers and ERK1/2 signaling in shERβ MDA-MB-231 cells, thus affecting ECM composition and subsequently increasing the aggressiveness of these cells. Syndecan-1 and the proteolytic milieu macromolecules, especially MMP2, MMP7 and MMP9, are the most affected among ECM macromolecules. Accordingly, the inhibition of miR-145 expression significantly increased the aggressiveness of shERβ MDA-MB-231 cells and induced EMT. Furthermore, miR-145 silencing resulted in striking changes in mRNA levels and protein expression of major ECM mediators, such as HER2 and several MMPs, whereas it significantly increased the phosphorylated levels of ERK1/2 kinases in these cells, suggesting the crucial role of miR-145 in this signaling pathway.In conclusion, these novel data suggest that the alterations in cell behavior and in ECM composition caused by ERβ suppression in MDA-MB-231 cells are closely related to certain epigenetic miRNA-induced alterations. Targeting the ERα/β-regulated miR-10b, miR-200b and miR-145 serves as a promising tool for early diagnosis and pharmaceutical targeting in aggressive, non-hormone-dependent breast cancer.

Οι οιστρογονοϋποδοχείς (ERs) κατέχουν κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού. Παρόλο που η συνεισφορά του ERα στη ρύθμιση της συμπεριφοράς των καρκινικών κυττάρων μαστού έχει μελετηθεί εκτενώς, οι βιολογικές δράσεις της ισομορφής του, ERβ, δεν είναι απολύτως αποσαφηνισμένες. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αποδείχθηκε ότι η καταστολή του ERβ στα επιθετικά, ERβ-θετικά, MDA-MB-231 καρκινικά κύτταρα μαστού (shERβ MDA-MB-231) οδήγησε σε αξιοσημείωτες φαινοτυπικές αλλαγές, καταστολή της διαδικασίας μετασχηματισμού από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο (ΕΜΤ), καθώς και σε σημαντικές διαφοροποιήσεις στις ιδιότητες και στα επίπεδα γονιδιακής και πρωτεϊνικής έκφρασης λειτουργικών συστατικών του εξωκυττάριου χώρου (ECM) των καρκινικών κυττάρων μαστού. Όπως παρατηρήθηκε από ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης, η καταστολή του ERβ επηρεάζει σημαντικά τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των shERβ MDA-MB-231 κυττάρων. Επιπλέον, η καταστολή του ERβ μειώνει την έκφραση των μεσεγχυματικών δεικτών fibronectin και vimentin, ενώ αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης του επιθηλιακού δείκτη Ε-cadherin και τις κυτταρικές διεπαφές. Οι συγκεκριμένες αλλαγές ακολουθούνται από μειωμένα επίπεδα των λειτουργικών ιδιοτήτων που προάγουν την επιθετικότητα των συγκεκριμένων καρκινικών κυττάρων, όπως ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση, η διήθηση και η προσκόλληση. Αξίζει να σημειωθεί ότι η καταστολή του ERβ μειώνει τη μετανάστευση των MDA-MB-231 καρκινικών κυττάρων μαστού μέσω των σηματοδοτικών μονοπατιών EGFR/IGF-IR και JAK/STAT. Επιπλέον, τα δεδομένα μας αποκάλυψαν ότι ο ERβ κατέχει κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφικής και πρωτεϊνικής έκφρασης σημαντικών τελεστών του ECM, όπως των μεμβρανικών συνδεκανών και της ενδοκυττάριας σεργλυκίνης, πολλών ΜΜΡs, συστατικών του συστήματος ενεργοποίησης του πλασμινογόνου και υποδοχέων κινάσης τυροσίνης. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ξεκάθαρα ότι ο ERβ αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή της κυτταρικής συμπεριφοράς και της σύστασης του ECM των υψηλού μεταστατικού δυναμικού, MDA-MB-231 καρκινικών κυττάρων μαστού, ανοίγοντας ένα νέο πεδίο έρευνας για την κατανόηση του ρόλου του και τη βελτίωση της φαρμακολογικής στόχευσης του μη-ορμονοεξαρτώμενου, επιθετικού καρκίνου του μαστού.Oι επιγενετικές αλλαγές είναι υπεύθυνες για την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να μεταναστεύουν. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αποδείξαμε ότι η έκφραση των ERs συνδέεται με τη διαφορική έκφραση πολλών miRNAs που σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου του μαστού, στα MCF-7 και MDA-MB-231 καρκινικά κύτταρα μαστού, ενώ κυρίως τα miR-10b (ογκογενετικό miRNA) και miR-200b (αναστολέας του ΕΜΤ) φαίνεται να είναι εκείνα που εμπλέκονται στη ρύθμιση της επιθετικής συμπεριφοράς των MDA-MB-231 κυττάρων. Μάλιστα η έκφρασή τους διαμεσολαβείται από τη διεπικοινωνία των σηματοδοτικών μονοπατιών EGFR/IGF-IR με τη 17β-οιστραδιόλη (E2). Επιπλέον, η καλλιέργεια των ERα-θετικών, MCF-7, και ERβ-θετικών, MDA-MB-231, κυττάρων σε μέσο καλλιέργειας απουσία οιστρογόνων, έχει διαφορετικό αντίκτυπο στην έκφραση των παραπάνω miRNAs και στη συμπεριφορά αυτών των κυττάρων, γεγονός που εξηγεί τη στοχευμένη επίδραση της E2 στην έκφραση των miRNAs, αναλόγως της έκφρασης των ERs στα καρκινικά κύτταρα μαστού. Παράλληλα, η καταστολή του ERβ στα MDA-MB-231 κύτταρα οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στα προφίλ έκφρασης συγκεκριμένων miRNAs, συμπεριλαμβανομένων των miR-10b, miR-200b και miR-145 (ογκοκατασταλτικό miRNA). Η υπερέκφραση του miR-10b είτε η αποσιώπηση του miR-145 στα shERβ MDA-MB-231 κύτταρα, αποκάλυψαν ότι τα συγκεκριμένα miRNAs ρυθμίζουν τις λειτουργικές ιδιότητες, το πρόγραμμα ΕΜΤ και την έκφραση σημαντικών τελεστών του ECM που είναι γνωστοί για την εμπλοκή τους στην επιθετικότητα του καρκίνου του μαστού. Τα δεδομένα έδειξαν ότι το miR-10b συμμετέχει ενεργά στη ρύθμιση των ιδιοτήτων, στην έκφραση δεικτών του ΕΜΤ και στη σηματοδότηση ERK1/2 στα shERβ MDA-MB-231 καρκινικά κύτταρα, επηρεάζοντας έτσι τη σύσταση του ECM, με αποτέλεσμα την ενίσχυση της επιθετικότητας των κυττάρων αυτών. Σημαντικότερη επίδραση παρουσιάζεται στη συνδεκάνη-1 και σε μόρια του πρωτεολυτικού καταρράκτη, κυρίως στις ΜΜΡ2, ΜΜΡ7, ΜΜΡ9. Αντίστοιχα, η καταστολή του miR-145 επήγαγε σημαντικά την επιθετικότητα των shERβ MDA-MB-231 κυττάρων καθώς και τη διαδικασία ΕΜΤ. Επιπλέον, η καταστολή της έκφρασης του συγκεκριμένου miRNA οδήγησε σε σημαντικές μεταγραφικές και πρωτεϊνικές αλλαγές των ρυθμιστών του ECM, όπως του HER2 και πολλών MMPs, ενώ επήγαγε τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των ERK1/2 κινασών σε αυτά τα κύτταρα, υποδηλώνοντας τον κρίσιμο ρόλο του miR-145 στην ενεργοποίηση του συγκεκριμένου σηματοδοτικού μονοπατιού.Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αποδεικνύουν ότι οι αλλαγές που παρατηρούνται στην κυτταρική συμπεριφορά και στη σύσταση του ECM από την καταστολή του ERβ στα MDA-MB-231 καρκινικά κύτταρα μαστού, είναι στενά συνδεδεμένες με συγκεκριμένες επιγενετικές τροποποιήσεις σε επίπεδο miRNAs. Καταλήγοντας, η στόχευση των ERα/β-ρυθμιζόμενων miR-10b, miR-200b και miR-145 αποτελεί ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για την έγκαιρη διάγνωση και την αποτελεσματική φαρμακολογική στόχευση του επιθετικού, μη-ορμονοεξαρτώμενου καρκίνου του μαστού.