Περίληψη
Από την ανάπτυξη του πρώτου βιοαισθητήρα από τον Leland C. Clark το 1962, η πρόοδος στον τομέα των βιοαισθητήρων είναι πρωτοφανής. Η αγορά των βιοαισθητήρων εκτιμάται ότι θα κοστίζει 27.06 δισεκατομμύρια δολάρια μέχρι το 2022. Επί του παρόντος, η επιστημονική έρευνα είναι επικεντρωμένη στην ανάπτυξη οικονομικών, μη επεμβατικών, ενσωματωμένων και φορητών βιοαισθητήρων που θα βρουν εφαρμογή στους τομείς της ταχείας διαγνωστικής, της ανάλυσης ποιότητας τροφίμων, του περιβαλλοντικού ελέγχου, της βιοάμυνας και της εγκληματολογίας. Η παρούσα διδακτορική έρευνα επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη ακουστικών βιοαισθητήρων που μπορούν να βρουν εφαρμογή στη μοριακή διαγνωστική. Οι ακουστικοί βιοαισθητήρες επιτρέπουν την βιολογική ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο και χωρίς την ανάγκη σήμανσης. Η έρευνα χρησιμοποίησε τα μοναδικά χαρακτηριστικά των ακουστικών βιοαισθητήρων για την ανάπτυξη βιοδοκιμών με εφαρμογή στους τομείς της ασφάλειας τροφίμων και της διαγνωστικής καρκίνου.Ο πρώτος στόχος της διατριβής ήτ ...
Από την ανάπτυξη του πρώτου βιοαισθητήρα από τον Leland C. Clark το 1962, η πρόοδος στον τομέα των βιοαισθητήρων είναι πρωτοφανής. Η αγορά των βιοαισθητήρων εκτιμάται ότι θα κοστίζει 27.06 δισεκατομμύρια δολάρια μέχρι το 2022. Επί του παρόντος, η επιστημονική έρευνα είναι επικεντρωμένη στην ανάπτυξη οικονομικών, μη επεμβατικών, ενσωματωμένων και φορητών βιοαισθητήρων που θα βρουν εφαρμογή στους τομείς της ταχείας διαγνωστικής, της ανάλυσης ποιότητας τροφίμων, του περιβαλλοντικού ελέγχου, της βιοάμυνας και της εγκληματολογίας. Η παρούσα διδακτορική έρευνα επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη ακουστικών βιοαισθητήρων που μπορούν να βρουν εφαρμογή στη μοριακή διαγνωστική. Οι ακουστικοί βιοαισθητήρες επιτρέπουν την βιολογική ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο και χωρίς την ανάγκη σήμανσης. Η έρευνα χρησιμοποίησε τα μοναδικά χαρακτηριστικά των ακουστικών βιοαισθητήρων για την ανάπτυξη βιοδοκιμών με εφαρμογή στους τομείς της ασφάλειας τροφίμων και της διαγνωστικής καρκίνου.Ο πρώτος στόχος της διατριβής ήταν η ακουστική ανίχνευση του τροφιμογενούς παθογόνου Salmonella Typhimurium. Δύο προσεγγίσεις ακολουθήθηκαν: η πρώτη χρησιμοποίησε έναν ακουστικό ανοσοαισθητήρα για την ανίχνευση ολόκληρων κυττάρων Salmonella Typhimurium. Ο βιοαισθητήρας πέτυχε την ανίχνευση των κυττάρων μέσα σε 30 λεπτά και με όριο ανίχνευσης τις 106 μονάδες σχηματισμού αποικίας/mL (106 cfu/mL). Η δεύτερη προσέγγιση χρησιμοποίησε έναν ακουστικό βιοαισθητήρα για την ενίσχυση και ανίχνευση της ενίσχυσης του γονιδίου invA της Salmonella Typhimurium επάνω στην ακουστική επιφάνεια. Για την ενίσχυση του γονιδίου χρησιμοποιήθηκε η ισόθερμη τεχνική recombinase polymerase amplification (RPA). Η ταυτόχρονη ανίχνευση των γονιδιακών αμπλικονίων πάνω στην επιφάνεια του βιοαισθητήρα έγινε με τη χρήση λιποσωμάτων που έδρασαν ως ενισχυτικοί ανιχνευτές. Η μεθοδολογία που παρουσιάστηκε για πρώτη φορά σε αυτή την έρευνα ήταν γρήγορη (ανίχνευση των γονιδιακών αμπλικονίων σε 5 μόνο λεπτά) και απλή (δε χρειάστηκαν μετα-ενισχυτικά βήματα επεξεργασίας των αμπλικονίων).Το δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής ασχολήθηκε με την ανάπτυξη ακουστικών βιοαισθητήρων για τη μοριακή διαγνωστική καρκίνου. Ένας DNA-βιοαισθητήρας σχεδιάστηκε για την ανίχνευση 4 microRNAs (miRNAS: miR-21, miR-155, miR-150, miR-107) που θεωρούνται δυναμικοί βιοδείκτες του καρκίνου του μαστού. Η ακουστική ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός μοναδικού ολιγονουκλεοτιδικού ιχνηθέτη. Μάλιστα, ο βιοαισθητήρας επέτρεψε τη γρήγορη, απλή και ταυτόχρονη ανίχνευση δύο miRNAs σε πραγματικό χρόνο και χωρίς τη χρήση μορίων επισήμανσης.Ο τελικός σκοπός της παρούσας δουλειάς ήταν η ανάπτυξη ενός ακουστικού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση KRAS μεταλλάξεων, χαρακτηριστικών του ορθοκολικού καρκίνου, παρόντων σε circulating tumor DNA (ctDNA) μόρια. Η ανίχνευση των KRAS μεταλλάξεων έγινε μέσω της υβριδοποίησης των ctDNA μορίων σε έναν peptide nucleic acid (PNA) ανιχνευτή πάνω στην επιφάνεια του αισθητήρα. Χρησιμοποιήθηκαν ακουστικοί αισθητήρες υψηλούς θεμελιώδους συχνότητας και μία πατενταρισμένη τεχνολογία που συνδυάζει νουκλεοβάσεις με τροποιημένη αλδεΰδη (SMART nucleobases) και μοναδικούς PNA ιχνηθέτες που φέρουν μία «κενή» θέση στον σκελετό τους (DGL probes). Η τεχνολογία που αναπτύχθηκε πέτυχε την ακουστική ανίχνευση KRAS μεταλλάξεων παρόντων σε μόρια ctDNA εισάγοντας μία νέα εναλλακτική στις τρέχουσες μεθόδους διάγνωσης του ορθοκολικού καρκίνου.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Since the development of the first biosensor by Leland C. Clark in 1962, the progress in the field of biosensors has been phenomenal. The biosensors market is estimated to reach US$ 27.06 billion by the year 2022 and, currently, scientific research is focused on the development of inexpensive, non-invasive, integrated and portable biosensors that will find application in point-of-care diagnostics, food and process control, environmental monitoring, biodefense, and forensics. The present PhD research focused on the development of acoustic wave-based bioassays that can be applied in molecular diagnostics. Acoustic wave biosensors offer real-time and label-free biological sensing. This study made use of the unique characteristics of acoustic wave biosensors in order to develop bioassays for food safety and cancer diagnostics.The first objective of this thesis was the acoustic detection of the foodborne pathogen Salmonella Typhimurium. Two approaches were followed: the first one made use o ...
Since the development of the first biosensor by Leland C. Clark in 1962, the progress in the field of biosensors has been phenomenal. The biosensors market is estimated to reach US$ 27.06 billion by the year 2022 and, currently, scientific research is focused on the development of inexpensive, non-invasive, integrated and portable biosensors that will find application in point-of-care diagnostics, food and process control, environmental monitoring, biodefense, and forensics. The present PhD research focused on the development of acoustic wave-based bioassays that can be applied in molecular diagnostics. Acoustic wave biosensors offer real-time and label-free biological sensing. This study made use of the unique characteristics of acoustic wave biosensors in order to develop bioassays for food safety and cancer diagnostics.The first objective of this thesis was the acoustic detection of the foodborne pathogen Salmonella Typhimurium. Two approaches were followed: the first one made use of an acoustic wave immunosensor for the detection of whole Salmonella Typhimurium cells. The biosensor developed was able to detect Salmonella Typhimurium cells of a concentration of 106 cfu/mL and within 30 min. The second approach employed an acoustic wave biosensor for the solid phase amplification of the gene invA of Salmonella Typhimurium via the recombinase polymerase amplification and simultaneous detection of DNA amplicons on the device surface. For amplicon detection, a novel methodology was described, where the formation of surface-bound DNA amplicons was detected by using liposomes as an amplification probe. The presented methodology was fast (detection of DNA amplicons after only 5 min of amplification) and simple (it did not require any post-amplification steps).The second part of the research work focused on the development of acoustic wave biosensors for molecular cancer diagnostics. A DNA-based biosensor was designed for the detection of four miRNAs (miR-21, miR-155, miR-150 and miR-107) considered being dynamic biomarkers of breast cancer. The miRNAs detection was achieved using a single oligonucleotide probe. In fact, the biosensor allowed the rapid, real-time, label-free and simple detection of two miRNAs at the same time.The final aim of this work was the development of an acoustic wave-based bioassay by which ctDNA carrying KRAS mutations that are characteristic of colorectal cancer would be acoustically detected via their hybridization to a PNA probe immobilized on the acoustic sensor surface; the assay employed a high fundamental frequency acoustic wave device and a patented technology which combines the patented aldehyde-modified SMART nucleobases with unique PNA capture probes synthesized with a “blank” position (DGL probes). This technology introduces an entirely chemical, rather than enzymatic, method for nucleic acid testing. The assay achieved the detection of KRAS mutations present on ctDNA introducing a new alternative to current colorectal cancer diagnostic techniques.
περισσότερα