Optimizing antifungal therapy against azole-resistant Aspergillus fumigatus isolates using an in vitro pharmacokinetic/pharmacodynamic simulation model

Abstract

The emergence of azole resistance raises concerns about first-line voriconazole treatment in high-risk patients with suspected invasive aspergillosis. Alternative therapeutic options are limited. A treatment strategy of growing interest for this difficult-to-treat infection is the combination of antifungals from distinct drug classes. The concentration-effect feature of this investigation could be amenable to pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) modeling as this approach may provide important information regarding the outcome. Accurate and validated in vitro PK/PD models may serve as useful tools in order to quantitatively assess the efficacy of combination therapy, while they can be used to perform more comprehensive experiments compared to animal models and clinical trials. In Chapter 2, a recently developed dynamic in vitro PK/PD model was evaluated based on the results obtained from a murine model of experimental aspergillosis using the same A. fumigatus strains and simulating mouse PK. Susceptibility breakpoints for voriconazole were then determined for different antifungal susceptibility testing methodologies applicable in the laboratory routine setting by simulating human PK and using A. fumigatus strains with distinct mechanisms of azole resistance. Moreover, the area under concentration-time curve (AUC) and trough levels of voriconazole in human serum required for optimal treatment and minimal toxicity were determined in relation to minimum inhibitory concentrations (MICs). The in vitro fAUC0-24/MIC associated with 50% antifungal activity was 28.61, close to the corresponding in vivo 14.67 fAUC0-24/MIC. Furthermore, the percentage target attainment was in agreement with the percentage efficacy in clinical trials of invasive aspergillosis in relation to CLSI MICs providing also a clinical correlation of the in vitro PK/PD model. The susceptible/ intermediate/resistant breakpoints were determined to be 0.25/0.5-1/2 mg/L for CLSI, 0.5/1-2/4 mg/L for EUCAST and 0.25/0.375-1/1.5 mg/L for gradient concentration strips. Hence, therapeutic drug monitoring could be used to optimize voriconazole therapy particularly against isolates with CLSI MICs of 0.5-1 mg/L and EUCAST MICs of 1-2 mg/L, targeting trough levels of 1 and 2 mg/L, respectively, whereas voriconazole should be avoided against isolates with CLSI and EUCAST MICs of >2 and >4 mg/L, respectively. Given the corroboration of the in vitro model with previous in vivo data, this tool may prove useful for predicting the in vivo outcome, while the determined susceptibility breakpoints and target values could assist in optimizing voriconazole therapy against A. fumigatus. After having optimized and validated the in vitro PK/PD model, as it reliably simulated voriconazole PK in human serum and correlated with in vivo outcomes observed in animal models and clinical trials, it was adapted to accommodate two drugs with different half-lives, thus enabling the study of drug combinations. Particularly, in Chapter 3.1, human serum concentration-time profiles of amphotericin B (q24h) and voriconazole (q12h) administered concomitantly were simulated in the in vitro system and the PD interactions against azole-susceptible and -resistant A. fumigatus strains were studied using Bliss independence and canonical mixture response surface analyses. In vitro PK/PD combination data were then combined with human PK data using Monte Carlo analysis and both target attainment rate and serum levels of combination therapy regimens were calculated for isolates with different MICs. Concentration-dependent interactions were found: synergy was observed at low amphotericin B-high voriconazole exposures, whereas antagonism was found at high amphotericin B-low voriconazole exposures for all isolates. By bridging in vitro PK/PD combination data with human PK, combination therapy resulted in 17 to 48% higher target attainment rates than those of monotherapy regimens for isolates with voriconazole/ amphotericin B MICs of 1 to 4 mg/L. The PD target was attained for combination regimens with a 1.1 tCmin/MIC for voriconazole and a 0.5 tCmax/MIC for amphotericin B, while the equally effective monotherapy regimens required a voriconazole tCmin/MIC ratio of 1.8 and an amphotericin B tCmax/MIC ratio of 2.8. Therapeutic drug monitoring could be employed to optimize antifungal combination therapy with low-dose (≤0.6 mg/kg) amphotericin B-based combination regimens against resistant isolates for minimal toxicity.In Chapter 3.2, the validated in vitro PK/PD model was used in order to investigate the PD effects of voriconazole/anidulafungin combination against A. fumigatus, including azole-resistant isolates, simulating human serum concentration-time profiles of standard and lower dosages of anidulafungin. PD interactions were assessed using Bliss independence analysis and Loewe additivity-based canonical mixture response-surface non-linear regression analysis. Target serum levels of combination regimens were determined for isolates with increasing MICs and target attainment rates were calculated for centers with different resistance rates using Monte Carlo analysis. Exposure- and MIC-dependent interactions were revealed: synergy was found at low anidulafungin (fCmax/MEC <10) and voriconazole (fAUC/MIC <10) exposures, whereas antagonism was observed at higher drug exposures. The largest increase in the probability of target attainment was found with 25 mg of anidulafungin and voriconazole MIC distributions with high (>10%) resistance rates, indicating that the combination of voriconazole with low-dose anidulafungin may increase the efficacy and reduce the cost and potential toxicity of antifungal therapy, particularly against azole-resistant A. fumigatus isolates and in patients with subtherapeutic serum levels. Based on the aforementioned results, therapeutic drug monitoring plays a critical role in the optimization of antifungal combination therapy, while its clinical use and value are related to accurate, rapid and cost-effective assays. Bioassays are frequently adopted and routinely performed because of their relative technical simplicity and low consumable and equipment costs. To date, there are no microbiological assays for measuring voriconazole serum concentration in patients on antifungal combination therapy for difficult-to-treat fungal infections. Hence, in Chapter 3.3 voriconazole levels were determined with high-performance liquid chromatography (HPLC) and a new microbiological agar diffusion assay in 103 serum samples from an HPLC-tested external quality control program (n=39), 21 patients receiving voriconazole monotherapy (n=39), and 7 patients receiving voriconazole-echinocandin combination therapy (n=25). The results of the bioassay were highly correlated with the HPLC results (Spearman's rank correlation coefficient >0.93, % difference <12 ± 3.8%). This is the first report in literature of a bioassay that can be used for measuring voriconazole serum concentration in the presence of echinocandins giving comparable results to HPLC.

Η ταχεία αύξηση στη συχνότητα εμφάνισης της αντοχής στις ιατρικές αζόλες προκαλεί ιδιαίτερη ανησυχία αναφορικά με τη θεραπεία πρώτης γραμμής με βορικοναζόλη σε ασθενείς υψηλού κινδύνου με υποψία διηθητικής ασπεργίλλωσης. Οι εναλλακτικές θεραπευτικές επιλογές είναι περιορισμένες. Μια θεραπευτική στρατηγική για αυτή τη δύσκολα ιάσιμη λοίμωξη που έχει συγκεντρώσει το ενδιαφέρον είναι ο συνδυασμός αντιμυκητιακών που ανήκουν σε διαφορετικές κατηγορίες φαρμάκων. Το χαρακτηριστικό γνώρισμα συγκέντρωσης φαρμάκου-επίδρασης θα μπορούσε να υποβληθεί σε φαρμακοκινητική/φαρμακοδυναμική (ΦΚ/ΦΔ) μοντελοποίηση, καθώς η συγκεκριμένη προσέγγιση μπορεί να παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την κλινική έκβαση. Ακριβή και επικυρωμένα in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλα μπορούν να χρησιμεύσουν ως χρήσιμα εργαλεία για την ποσοτική εκτίμηση της αποτελεσματικότητας της συνδυαστικής θεραπείας, ενώ μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτέλεση πιο εκτεταμένων πειραμάτων σε σύγκριση με ζωικά μοντέλα και κλινικές δοκιμές.Στο Κεφάλαιο 2, ένα πρόσφατα αναπτυχθέν δυναμικό in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλο αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από ένα πειραματικό μυϊκό μοντέλο ασπεργίλλωσης χρησιμοποιώντας τα ίδια στελέχη A. fumigatus και προσομοιώνοντας τη ΦΚ στον ορό των ποντικών. Στη συνέχεια, προσομοιώνοντας τη ΦΚ στον ανθρώπινο ορό και χρησιμοποιώντας στελέχη A. fumigatus με διακριτούς μηχανισμούς αντοχής στις αζόλες, προσδιορίστηκαν τα όρια ευαισθησίας στη βορικοναζόλη για διαφορετικές μεθοδολογίες που εφαρμόζονται στην καθημερινή εργαστηριακή πρακτική για τον έλεγχο ευαισθησίας στα αντιμυκητιακά. Επιπροσθέτως, προσδιορίστηκαν η περιοχή κάτω από την καμπύλη συγκέντρωσης-χρόνου (AUC) και τα ελάχιστα επίπεδα βορικοναζόλης στον ανθρώπινο ορό που απαιτούνται για τη βέλτιστη θεραπευτική αποτελεσματικότητα και την ελάχιστη δυνατή εμφάνιση τοξικότητας σε σχέση με τις ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις (MICs). Η in vitro fAUC0-24/MIC που αντιστοιχεί στο 50% της μέγιστης αντιμυκητιακής δράσης ήταν 28.61, παραπλήσια της αντίστοιχης 14.67 fAUC0-24/MIC που βρέθηκε στα πειραματόζωα. Εκ παραλλήλου, το ποσοστό επίτευξης στόχου βρέθηκε σύμφωνο με την ποσοστιαία αποτελεσματικότητα του φαρμάκου σε σχέση με τις CLSI MICs σε κλινικές μελέτες διηθητικής ασπεργίλλωσης, παρέχοντας μια επιπλέον σημαντική κλινική συσχέτιση του in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλου. Τα όρια ευαισθησίας για την ανίχνευση ευαίσθητων/μετρίως ευαίσθητων/ανθεκτικών στη βορικοναζόλη στελεχών προσδιορίσθηκαν να είναι 0.25/0.5-1/2 mg/L και 0.5/1-2/4 mg/L για τη μέθοδο αραιώσεων σε ζωμό κατά CLSI και EUCAST, αντίστοιχα, και 0.25/0.375-1/1.5 mg/L για τη μέθοδο ταινιών διαβαθμισμένης συγκέντρωσης. Ως εκ τούτου, η παρακολούθηση επιπέδων βορικοναζόλης δύναται να χρησιμοποιηθεί με σκοπό τη βελτιστοποίηση της θεραπείας, ιδιαίτερα έναντι στελεχών με CLSI MIC 0.5-1 mg/L και EUCAST MIC 1-2 mg/L, στοχεύοντας σε ελάχιστες συγκεντρώσεις 1 και 2 mg/L, αντίστοιχα, ενώ η χορήγηση βορικοναζόλης θα πρέπει να αποφεύγεται έναντι στελεχών με CLSI και EUCAST MICs >2 και >4 mg/L, αντίστοιχα. Δεδομένης της επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων του in vitro μοντέλου με προηγούμενα in vivo δεδομένα, το προκλινικό αυτό εργαλείο μπορεί να αποδειχθεί τελεσφόρο για την πρόβλεψη του in vivo αποτελέσματος, ενώ τα προτεινόμενα όρια ευαισθησίας και οι προσδιοριζόμενες τιμές-στόχοι θα μπορούσαν να συμβάλουν στη βελτιστοποίηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας.Κατόπιν της βελτιστοποίησης και επικύρωσης του in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλου, δεδομένης της αξιόπιστης προσομοίωσης της ΦΚ της βορικοναζόλης στον ανθρώπινο ορό και της συσχέτισης με in vivo δεδομένα ζωικών μοντέλων και κλινικών δοκιμών, το σύστημα προσαρμόστηκε για την ταυτόχρονη μελέτη δύο φαρμάκων με διαφορετικούς χρόνους ημίσειας ζωής επιτρέποντας έτσι τη διερεύνηση του συνδυασμού τους. Συγκεκριμένα, στο Κεφάλαιο 3.1, προσομοιώθηκαν τα προφίλ συγκέντρωσης-χρόνου της αμφοτερικίνης Β (κάθε 24 ώρες) και της βορικοναζόλη (κάθε 12 ώρες) στον ανθρώπινο ορό και μελετήθηκαν οι ΦΔ αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα κατά τη συγχορήγηση τους έναντι ευαίσθητων και ανθεκτικών στις αζόλες στελεχών A. fumigatus χρησιμοποιώντας το κριτήριο ανεξαρτησία κατά Bliss και την ανάλυση επιφάνειας-απόκρισης κανονικών μειγμάτων. Ακολούθως, προκειμένου να γεφυρωθούν τα in vitro ΦΚ/ΦΔ δεδομένα με στοιχεία της ΦΚ στον άνθρωπο, διεξήχθη ανάλυση προσομοίωσης Monte Carlo, οπότε και προσδιορίστηκαν τόσο τα ποσοστά επίτευξης στόχου όσο και τα επίπεδα των συγχορηγούμενων φαρμάκων που απαιτούνται προκειμένου να επιτευχθεί η κλινικά σημαντική in vitro ΦΚ/ΦΔ παράμετρος για διαφορετικές MICs. Παρατηρήθηκαν δοσο-εξαρτώμενες αλληλεπιδράσεις: συνέργεια βρέθηκε κατά την έκθεση σε χαμηλές συγκεντρώσεις αμφοτερικίνης Β-υψηλές συγκεντρώσεις βορικοναζόλης, ενώ ανταγωνισμός σε υψηλές συγκεντρώσεις αμφοτερικίνης Β-χαμηλές συγκεντρώσεις βορικοναζόλης για όλα τα εξεταζόμενα στελέχη. Ο ΦΔ στόχος επιτεύχθηκε για σχήματα συνδυασμού με αναλογίες συγκέντρωσης φαρμάκου στον ορό/MIC 1.1 tCmin/MIC για τη βορικοναζόλη και 0.5 tCmax/MIC για την αμφοτερικίνη Β, ενώ για τα εξίσου αποτελεσματικά σχήματα μονοθεραπείας απαιτούνταν αναλογίες 1.8 tCmin/MIC και 3.4 tCmax/MIC, αντίστοιχα. Επεκτείνοντας τα in vitro ευρήματα στον άνθρωπο, o συνδυασμός αμφοτερικίνης Β-βορικοναζόλης είχε ως αποτέλεσμα 17 έως 48% υψηλότερα ποσοστά επίτευξης στόχου συγκριτικά με τις αντίστοιχες μονοθεραπείες, ιδιαίτερα στην περίπτωση στελεχών με βορικοναζόλη/αμφοτερικίνη Β MICs 1-4 mg/L. Η παρακολούθηση επιπέδων φαρμάκων θα μπορούσε να εφαρμοσθεί στοχεύοντας στη βελτιστοποίηση της συνδυαστικής θεραπείας με χαμηλής δόσης (≤0,6 mg/kg) αμφοτερικίνη Β-συνδυαστικά δοσολογικά σχήματα έναντι αζολο-ανθεκτικών στελεχών με την εμφάνιση ελάχιστης δυνατής τοξικότητας. Στο Κεφάλαιο 3.2, διερευνήθηκαν οι ΦΔ αλληλεπιδράσεις του συνδυασμού βορικοναζόλης-ανιντουλαφουγκίνης έναντι A. fumigatus, συμπεριλαμβανομένων αζολο-ανθεκτικών στελεχών, προσομοιώνοντας τα προφίλ επιπέδων ανιντουλαφουγκίνης-χρόνου στον ανθρώπινο ορό για την καθιερωμένη και χαμηλότερες δοσολογίες της με τη βοήθεια του επικυρωμένου in vitro ΦΚ/ΦΔ μοντέλου. Οι ΦΔ αλληλεπιδράσεις αναλύθηκαν με το κριτήριο ανεξαρτησίας κατά Bliss και τη μη-γραμμική ανάλυση επιφάνειας-απόκρισης κανονικών μειγμάτων βασισμένη στην προσθετικότητα κατά Loewe . Τα ποσοστά επίτευξη στόχου εκτιμήθηκαν για διαφορετικές δόσεις ανιντουλαφουγκίνης και για νοσοκομειακά κέντρα με αυξανόμενα ποσοστά αντοχής στις αζόλες με προσομοίωση Monte Carlo. Εντοπίστηκαν δοσο- και MIC-εξαρτώμενων αλληλεπιδράσεις: συνέργεια παρατηρήθηκε σε χαμηλές συγκεντρώσεις ανιντουλαφουγκίνης (fCmax/MΕC<10) και βορικοναζόλης (fCmax/MIC<10), ενώ ανταγωνισμός βρέθηκε σε υψηλότερες. Η μεγαλύτερη αύξηση στην πιθανότητα επίτευξης στόχου εντοπίστηκε με τη δόση των 25mg ανιντουλαφουγκίνης και για κατανομές MIC βορικοναζόλης με υψηλά ποσοστά αντοχής (>10%), υποδεικνύοντας ότι η χαμηλή δόση ανιντουλαφουγκίνης δύναται να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα και να μειώσει το κόστος της συνδυαστικής θεραπείας, ιδιαίτερα έναντι αζολο-ανθεκτικών στελεχών A. fumigatus και σε ασθενείς με υποθεραπευτικά επίπεδα στον ορό.Βάσει των προαναφερθέντων αποτελεσμάτων, η παρακολούθηση επιπέδων φαρμάκων διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη βελτιστοποίηση της αντιμυκητιακής συνδυαστικής θεραπείας, ενώ για να έχει κλινική αξία και λόγο να πραγματοποιηθεί πρέπει να υπάρχουν ακριβείς, γρήγορες και αποδοτικές του κόστους μέθοδοι προσδιορισμού. Οι μικροβιολογικές δοκιμασίες υιοθετούνται συχνά και χρησιμοποιούνται συστηματικά δεδομένου ότι χαρακτηρίζονται από τεχνική απλότητα και χαμηλό κόστος αναλώσιμων και εξοπλισμού. Εντούτοις, δεν έχουν αναπτυχθεί έως τώρα μικροβιολογικές δοκιμασίες προσδιορισμού της βορικοναζόλης σε περιπτώσεις χορήγησης συνδυαστικής θεραπείας αντιμυκητιακών για δύσκολα θεραπεύσιμες λοιμώξεις. Ως εκ τούτου, στο Κεφάλαιο 3.3 τα επίπεδα βορικοναζόλης προσδιορίστηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) και με μια νέα μικροβιολογική τεχνική διάχυσης σε άγαρ σε 103 δείγματα ορού προερχόμενα από ένα πρόγραμμα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας (n=39), 21 ασθενείς υπό μονοθεραπεία βορικοναζόλης (n=39) και 7 ασθενείς που έλαβαν συνδυαστική θεραπεία βορικοναζόλης-εχινοκανδίνης (n=25). Τα αποτελέσματα της αναπτυχθείσας μικροβιολογικής μεθόδου συσχετίστηκαν σημαντικά με τα αντίστοιχα της HPLC (συντελεστής συσχέτισης Spearman >0.93, % διαφορά <12 ± 3.8%). Για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία αναπτύχθηκε μια μικροβιολογική μέθοδος βασιζόμενη στη διάχυση σε άγαρ για τον προσδιορισμό επιπέδων βορικοναζόλης σε δείγματα ορού ασθενών που λαμβάνουν συνδυαστική θεραπεία με εχινοκανδίνες, η οποία δίνει συγκρίσιμα αποτελέσματα με την HPLC.