Ο ρόλος των πρωτεϊνών του συμπλέγματος των υποδοχέων της ακτιβίνης Α στη μεταγωγή του σήματος και τη βιολογική δραστικότητά της

Abstract

TGF-β superfamily members regulate a wide range of biological processes, such as cell proliferation, differentiation, maintenance of pluripotency and angiogenesis. Activin A, a cytokine of TGF-β superfamily, binds to heterotetrameric complexes of type I and type II Ser/Thr kinase receptors and transduce signals through SMAD2 and SMAD3, promoting the transcription of target genes. In order to orchestrate diverse biological functions, signaling is tightly regulated, both spatially and temporally. The spatial organization and trafficking of ligand-receptor complexes is critical in signal transduction. Internalization of cargo proteins is carried out by various endocytic pathways, such as clathrin-dependent endocytosis, as well as clathrin-independent pathways. Sorting events initiated at early endosomes determine the fate of cargo, including signaling propagation, recycling to the plasma membrane or degradation. The target of our research was to investigate which endocytic routs internalize the complex of Activin-Receptors and the impact of trafficking events on Activin A signaling. Finally, since Activin A plays a prominent role in biology of human embryonic stem cells (hESCs), where signaling and trafficking events of Activin A/receptor complexes are mainly unknown, the current effort is to apply our knowledge to hESCs. Our first goal was to test which endocytic routs are utilized from Activin A-receptor complex on endothelial cells, and to address the role of known regulators of trafficking on Activin A signaling. We found that dynamin dependent routs, such as clathrin and caveolin dependent endocytosis, affect Activin A signaling. Knock down of clathrin and caveolin, significantly down regulated the phosphorylation of SMAD2/3, but it didn’t change the internalization of ActivinA-Alexa488. It seems that the main endocytic route for Activin A is macropinocytosis. ActivinA-Alexa488 colocalises with Detran-TexasRed and Rabankyrin-5 on large vesicles, with size bigger that 0,2 μm, defined as macropinosomes. Knock down of Rabankyrin-5 decreases the phosphorylation of SMAD2/3 and the internalization of ligand. The opposite effect caused the overexpression of this protein. These results are in agreement with those performed using know macropinocytosis inhibitors, such as EIPA, Cytochalasin D and LY249002. Also, Activin A induces macropinocytosis, since it upregulates Dextran-TexasRed uptake in HUVECs, and causes membrane ruffling and actin filaments reorganization. Additionally, we tried to apply our knowledge on stem cell lineages, repeating some key experiments. The results show that the regulation of Activin A signaling through endocytosis differs between pluripotent, multipotent and differentiated cells. Macropinocytosis is either absent or is not affecting Activin A signaling on stem cells. Taking advantage of a microarray analysis performed for our lab, we detected two phosphatases with distinct expression levels between the cell lines used, which are absent in pluripotent cells. These phosphatases are MTMR6 and INNP4B, and considered to be indispensable for the closure of macropinosomes and the completion of this process. We confirmed these results with qRT-PCR, which showed that these proteins are expressed in multipotent (MSCs) and differentiated cells (HEFs, HUVECs). Taking together our research provides new data regarding signaling and endocytosis events of Activin A-receptor complex, emerging a new role for macropinocytosis. The effort to expand our research on cells lines, with different state of differentiation, is still in progress. Precocious data are very interesting, so we hope to shed more light on Activin A research, in the immediate future.

Τα μέλη της υπεροικογένειας του TGF-β συμμετέχουν στη ρύθμιση πολλών βιολογικών φαινομένων, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η αγγειογένεση. Η Ακτιβίνη Α, μια κυτταροκίνη της υπεροικογένειας, προσδένεται σε ετεροτετραμερή σύμπλοκα υποδοχέων κινάσης σερίνης/θρεονίνης και μετάγει τα σήματά της μέσω των SMAD2/3, προάγοντας τη μεταγραφή των γονιδίων-στόχων. Η χωρoχρονική οργάνωση της ενδοκυττάρωσης και διακίνησης του συμπλόκου προσδέματος-υποδοχέα είναι κρίσιμη στη μεταγωγή του σήματος. Η εσωτερικοποίηση του φορτίου πραγματοποιείται μέσω διαφορετικών οδών ενδοκυττάρωσης. Η διαλογή του φορτίου στο πρώιμο ενδόσωμα, καθορίζει την ενίσχυση της σηματοδότησης, την ανακύκληση στη πλασματική μεμβράνη και την αποδόμηση του φορτίου. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διαλεύκανση των οδών ενδοκυττάρωσης που χρησιμοποιούνται από το σύμπλοκο Ακτιβίνης-υποδοχέων και η μελέτη της επίδρασης της μεμβρανικής διακίνησης στη σηματοδότηση της Ακτιβίνης Α. Τέλος, καθώς η Ακτιβίνη διαδραματίζει πρωταγωνιστικό ρόλο στη βιολογία των ανθρώπινων εμβρυϊκών κυττάρων (hESCs), όπου οι μηχανισμοί ενδοκυττάρωσης και σηματοδότησης παραμένουν άγνωστοι, επιδίωξή μας ήταν να επεκτείνουμε την έρευνά μας στα hESCs. Αρχικά, βρήκαμε ότι τα μονοπάτια που εξαρτώνται από τη δυναμίνη, της κλαθρίνης και της καβεολίνης, επηρεάζουν στη σηματοδότηση της Ακτιβίνης Α. Η αποσιώπηση τους μειώνει σημαντικά τη φωσφορυλίωση των SMAD2/3, αλλά δεν επηρεάζει την ενδοκυττάρωση της σημασμένης Ακτιβίνης. Φαίνεται ότι η κύρια οδός εσωτερικοποίησης είναι η μακροπινοκυττάρωση. Η σημασμένη Ακτιβίνη συνεντοπίζεται με τη πρωτεΐνη Detran-TexasRed και τη Rabankyrin-5 σε μεγάλα κυστίδια (˃0.2μm), που χαρακτηρίζονται ως μακροπινοσώματα. Η αποσιώπηση της Rabankyrin-5 μειώνει δραστικά τη φωσφορυλίωση των SMAD2/3 αλλά και την εσωτερικοποίηση του προσδέματος. Αντίθετο αποτέλεσμα έχει η υπερέκφραση της πρωτεΐνης αυτής. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με εκείνα της χρήσης αναστολέων της μακροπινοκυττάρωσης, όπως οι EIPA, Cytochalasin D και LY249002. Τέλος, η Ακτιβίνη Α επάγει τη μακροπινοκυττάρωση καθώς αυξάνει την ενδοκυττάρωση της Dextran-TexasRed στα κύτταρα HUVEC, και προκαλεί την πτύχωση της μεμβράνης και την αναδιοργάνωση των ινιδίων της ακτίνης. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων σε σειρές ανθρώπινων βλαστικών κυττάρων δείχνουν ότι η σχέση ενδοκυττάρωσης σηματοδότησης είναι διαφορετική, συγκρινόμενη με τα τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα. Με ανάλυση μικροσυστοιχιών και qRT-PCR εντοπίστηκαν δύο φωσφατάσες με αρκετά διαφορετική έκφραση ανάμεσα στις κυτταρικές σειρές πολυδύναμων, ολιγοδύναμων και διαφοροποιημένων κυττάρων. Οι φωσφατάσες αυτές είναι οι MTMR6 και INNP4Β, που θεωρούνται απαραίτητες για την ολοκλήρωση της μακροπινοκυττάρωσης. Συμπερασματικά, η έρευνά μας προσφέρει νέα δεδομένα στη σχέση ενδοκυττάρωσης-σηματοδότησης της Ακτιβίνης Α, αναδεικνύοντας έναν νέο ρόλο της μακροπινοκυττάρωσης. Η προσπάθειά μας να διευρύνουμε τα αποτελέσματα σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές, βλαστικές και διαφοροποιημένες, συνεχίζεται ακόμη. Τα πρώιμα δεδομένα είναι πολύ ενδιαφέροντα, κι έτσι ελπίζουμε ότι θα ρίξουμε νέο φως στο πεδίο της Ακτιβίνης Α στο άμεσο μέλλον.