Διερεύνηση των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής CDT1 και Geminin στα καρκινικά βλαστικά κύτταρα και την καρκινογένεση

Abstract

Geminin, a DNA replication licensing inhibitor, together with its interacting partner Cdt1, ensure faithful DNA replication in vertebrates. Several studies have shown that Cdt1 overexpression or Geminin depletion in vitro results in rereplication and DNA damage, while increased expression of Geminin has been observed in human cancers. In order to examine its role in vivo, we conditionally inactivated Geminin in the murine colon and lung and assessed chemically induced carcinogenesis. We show here that mice lacking Geminin develop a significantly higher number of tumors and bear a larger tumor burden compared to sham-treated controls, in urethane-induced lung and AOM/DSS-induced colon carcinogenesis. Survival is also significantly reduced in mice lacking Geminin during lung carcinogenesis. A significant increase in the total number and grade of lesions (hyperplasias, adenomas and carcinomas) was also confirmed by H&E. Moreover, increased genomic instability, identified by increased ATR and γH2AX expression, was detected through immunohistochemistry analysis. In addition, we further analysed Geminin expression in human colon cancer and found increased expression, as well as positive correlation with ATM/ATR levels and a non-monotonic association with γH2AX. As a result, our data demonstrate that Geminin acts as a tumor suppressor by safeguarding genome stability, while its overexpression is also associated with genomic instability. Furthermore, in order to assess Cdt1's role in tumorigenesis in vivo, we generated mice conditionally overexpressing the Cdt1 gene.

Η Geminin, ένας αναστολέας της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA, μαζί με την αλληλεπιδρώντα πρωτεΐνη Cdt1, εξασφαλίζουν την σωστή αντιγραφή του DNA στα σπονδυλωτά. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση της Cdt1 ή η απαλοιφή της Geminin in vitro οδηγεί σε επαναντιγραφή και βλάβες στο DNA, ενώ αυξημένη έκφραση της Geminin έχει παρατηρηθεί σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους. Προκειμένου να εξετάσουμε το ρόλο της in vivo, αποσιωποιήσαμε το γονίδιο της Geminin στο παχύ έντερο και τον πνεύμονα των μυών και προκαλέσαμε χημική καρκινογένεση. Σε αυτή την διατριβή δείχνουμε ότι οι μύες που στερούνται την έκφραση της πρωτεΐνης Geminin αναπτύσσουν σημαντικά υψηλότερο αριθμό όγκων και φέρουν μεγαλύτερο φορτίο όγκου σε σύγκριση με τους μύες ελέγχου, κατά τη διάρκεια της χημικής καρκινογένεσης. Πιο συγκεκριμένα, κατά τη διάρκεια της πνευμονικής καρκινογένεσης όλοι οι μύες υποβλήθηκαν σε ενέσεις ουρεθάνης ενώ για την επαγωγή της καρκινογένεσης του παχέως εντέρου, οι μύες υποβλήθηκαν στα χημικά AOM και DSS. Η επιβίωση μειώνεται επίσης σημαντικά σε μύες που δεν εκφράζουν Geminin κατά τη διάρκεια της πνευμονικής καρκινογένεσης. Στατιστικά σημαντική αύξηση του συνολικού αριθμού και του βαθμού των αλλοιώσεων (υπερπλασίες, αδενώματα και καρκινώματα) παρατηρήθηκε μετά από χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη. Επιπλέον, ανιχνεύθηκε αυξημένη γενωμική αστάθεια, μέσω αυξημένης έκφρασης των πρωτεϊνών ATR και γΗ2ΑΧ. Στη συνέχεια, αναλύσαμε περαιτέρω την έκφραση της Geminin στον καρκίνο του ανθρώπινου παχέως εντέρου και βρήκαμε αυξημένη έκφραση, καθώς και μια θετική συσχέτιση με τα επίπεδα ΑΤΜ/ATR και μια μη-μονοτονική συσχέτιση με τα επίπεδα της γΗ2ΑΧ. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν έναν ογκοκατασταλτικό ρόλο για την Geminin, που δρα προστατεύοντας τη σταθερότητα του γονιδιώματος, ενώ ταυτόχρονα η υπερέκφραση της σχετίζεται επίσης με τη γονιδιωματική αστάθεια. Επιπλέον, προκειμένου να εκτιμηθεί ο ρόλος της Cdt1 στην καρκινογένεση in vivo, δημιουργήσαμε ποντίκια που υπερεκφράζουν υπό όρους το γονίδιο Cdt1.