Μελέτη μοριακών μηχανισμών αντικαρκινικής δράσης της σιλιμπινίνης (silibinin)

Abstract

Cancer prevention with the use of phytochemicals has attracted increased attention in recent years. Different phytochemicals have been associated with important chemopreventive potential against cancer including silibinin. Silibinin is the major active and most abundant ingredient of the silymarin complex derived from the seeds of the plant Silybum marianum (L) Gaertn. Silibinin (also silybin) that consists of a diastereoisomeric mixture of silybin A-B has been reported to possess strong chemopreventive and antineoplastic ability through pleiotropic mechanisms of action against different types of cancer, including prostate. The present study aimed to examine the molecular mechanisms by which silibinin exerts its anticancer activity in preclinical prostate cancer models, while it focused on its potential ability to interfere with and regulate major components of the epigenetic machinery, often deregulated and implicated in the pathogenesis of Prostate Cancer (PCa). Silibinin possessed significant antiproliferative activity against prostate cancer cells DU-145 and PC-3, mediated in part by inhibition of cell cycle in G1-G2/M phases, along with differential regulation of cyclins D and B, cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKIs) p21 and p27 expression levels, and inhibition of their metastatic potential, as observed by immunoblot and wound healing assays. At an epigenetic level, silibinin reduced gene expression levels of PRC2 complex members (EZH2, EED, SUZ12), as evidenced by real-time PCR analysis. Specifically, the reduction of EZH2 levels was accompanied by increased levels of tri-methylated histone H3 at lysine 27 residues (H3K27me3), as evidenced by immunoblot and immunofluorescence analysis, a response that appeared to be a direct consequence of the reduced Akt and EZH2 phosphorylation levels in silibinin treatments. Furthermore, silibinin caused a modest increase in DNA methyltransferase activity, while reduced the expression levels of HOXA9 gene, a downstream target of EZH2, and decreased protein levels of histone deacetylases 1-2 (HDAC1-2). Interestingly, human epigenetic chromatin modification enzymes-focused DNA microarray and real-time quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) analyses revealed that silibinin altered differentially the expression of important epigenetic enzymes associated with gene expression regulation through modification of chromatin configuration, including members of the families of histone methyltransferases (SUV39H1), acetyltransferases (KAT6B), demethylases (KDM1) and deacetylases (HDAC1-3), along with enzymes that induce gene silencing via DNA methylation (MBD2) and regulate cell cycle progression (AURKA-B). Finally, SRB analysis revealed that silibinin enhanced the antiproliferative action of several epigenetic drugs, including 5-AZA cdR, SAHA and TSA, in a dose- and time-dependent manner in PCa cells. In conclusion, our study suggests, that the reported anticancer activity of silibinin in prostate cancer could be mediated, at least in part, through the disruption of central processes in chromatin conformation and alteration of key epigenetic enzymes regulating progression of the disease. Further studies are required to clarify in detail the precise molecular mechanism(s) that govern the pleiotropic action of silibinin against PCa towards this direction.

Η πρόληψη του καρκίνου με τη χρήση φυτοχημικών ουσιών έχει παρουσιάσει αυξημένο ενδιαφέρον τα τελευταία χρόνια. Μεταξύ των διαφόρων φυτοχημικών που έχουν συσχετιστεί με σημαντική χημειοπροληπτική δράση έναντι του καρκίνου, συγκαταλέγεται και η ουσία σιλιμπινίνη. Η σιλιμπινίνη (silibinin/silybin) αποτελεί το σημαντικότερο ενεργό συστατικό του συμπλόκου της σιλυμαρίνης εκχυλίσματος που προέρχεται από τους σπόρους του φυτού Silybum marianum (L) Gaertn. Η σιλιμπινίνη, η οποία αποτελεί διαστερεοϊσομερικό μίγμα σιλιμπινίνης Α και Β, έχει χαρακτηριστεί από ισχυρή χημειοπροληπτική και αντικαρκινική ικανότητα μέσω πλειοτροπικής δράσης έναντι διαφόρων τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου και του προστάτη. Ο στόχος της έρευνάς μας ήταν να διελευκάνουμε τους μοριακούς μηχανισμούς μέσω των οποίων η σιλιμπινίνη ασκεί την αντικαρκινική της δράση σε προκλινικά μοντέλα καρκίνου του προστάτη, δίνοντας έμφαση στην πιθανή ικανότητά της να παρεμβαίνει και να ρυθμίζει σημαντικά μέλη των επιγενετικών μηχανισμών, που παρουσιάζονται απορρυθμισμένα και εμπλέκονται στην παθογένεση της νόσου. Η σιλιμπινίνη παρουσίασε σημαντική αντιπολλαπλασιαστική δράση έναντι των καρκινικών κυττάρων του προστάτη DU-145 και PC-3, η οποία μεσολαβείται εν μέρει από την αναστολή του κυτταρικού κύκλου στις φάσεις G1 και G2/M, τη διαφορική ρύθμιση των κυκλινών D και Β, και των εξαρτώμενων από τις κυκλίνες αναστολέων ρ21 και ρ27, καθώς και την αναστολή του μεταστατικού τους δυναμικού, όπως προέκυψε από ανάλυση ανοσοαποτυπώματος και επούλωσης τραύματος. Σε επιγενετικό επίπεδο, η σιλιμπινίνη προκάλεσε μείωση των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης των μελών του συμπλόκου PRC2 (EZH2, EED και SUZ12) που σχετίζονται με τη γονιδιακή καταστολή, μέσω της ενζυμικής δράσης της μεθυλοτρανσφεράσης ΕΖΗ2. Ειδικότερα, η επαγόμενη από τη σιλιμπινινη μείωση των επιπέδων της ΕΖΗ2 συνοδεύτηκε από αύξηση της τριμεθυλίωσης της ιστόνης Η3 σε κατάλοιπα λυσίνης 27 (Η3Κ27me3), όπως προέκυψε από ανάλυση ανοσοαποτυπώματος και ανοσοφθορισμού, απόκριση η οποία μεσολαβείται εν μέρει από τα μειωμένα επίπεδα φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών Αkt και ΕΖΗ2. Επιπλέον, η σιλιμπινίνη προκάλεσε μέτρια αύξηση της δραστικότητας των μεθυλοτρανσφερασών του DNA, ενώ μείωσε τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου HOXA9, καθοδικού στόχου της EZH2, και τα πρωτεϊνικά επίπεδα των απακετυλασών των ιστονών 1-2 (HDAC1-2). Παράλληλα, η σιλιμπινίνη προκάλεσε μεταβολή της έκφρασης σημαντικών επιγενετικών ενζύμων που σχετίζονται με τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μέσω τροποποίησης της χρωματινικής διαμόρφωσης, συμπεριλαμβανομένων διαφορετικών μελών των μεθυλοτρανσφερασών (SUV39H1), ακετυλοτρανσφερασών (KAT6B), απομεθυλασών (KDM1) και απακετυλασών (HDAC1-2) των ιστονών, καθώς και ενζύμων που εμπλέκονται στην αποσιώπηση γονιδίων μέσω μεθυλίωσης του DNA (MBD2) και ρυθμίζουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (AURKA-B). Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι η σιλιμπινίνη ενίσχυσε την αντιπολλαπλασιαστική δράση διαφορετικών επιγενετικών φαρμάκων, συμπεριλαμβανομένων του αναστολέα των μεθυλοτρανσφερασών του DNA 5-ΑΖΑ cdR, καθώς και των αναστολέων των ιστονικών απακετυλασών SAHA και TSA σε κύτταρα DU-145 και PC-3. Συμπερασματικά τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν οτι η αντικαρκινική δράση της σιλιμπινίνης στον καρκίνο του προστάτη πιθανόν να μεσολαβείται εν μέρει μέσω ρύθμισης της χρωματινικής διαμόρφωσης και τροποποίησης επιγενετικών ενζύμων που εμπλέκονται στην εξέλιξη και πρόοδο της νόσου. Επιπλέον μελέτες θα αποσαφηνίσουν τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν την πλειοτροπική δράση της σιλιμπινίνης στον καρκίνο του προστάτη προς αυτή την κατεύθυνση.