Nanotherapeutic approaches to epithelial cancers

Abstract

Cancer is a leading cause of death worldwide and its global burden continues to rise, largely because of the growth and aging of the world population. Resistance to cell death and reprogramming of metabolic pathways are two hallmarks of human cancer cells as well as major causes of chemotherapy inefficacy. After conventional chemotherapy, a high percentage of patients is inevitably prone to profound toxicity in normal cells/tissue and drug resistance. The past few years advanced nanomedicines have been shown to be more effective than conventional chemotherapy. Furthermore, effectiveness of cancer battling can be improved substantially if chemotherapeutics cytotoxicity is combined with anticancer immunosurveillance. In this thesis, the development of a targeted drug nanodelivery platform, against tumor microenvironment, targeting endosialin/tumor endothelial marker 1 (TEM1)/CD248 is described. Biocompatible, and biodegradable polylactide-co-glycolide acid (PLGA) nanoparticles (NPs) loaded with shikonin (SHK) and coated with polyethyleneglycol (PEG) and anti-TEM1 targeting device (whole antibody, antibody’s Fc part or antibody’s scFv part) were designed and formulated. Based on particle size analysis and electron microscopy, the engineered NPs showed a smooth spherical shape with size ranging between 100-125 nm and a zeta potential value of -30 to -40 mV. Drug entrapment and bioconjugation efficiency reached ~92% and ~90% respectively. SHK showed sustained-release profile in PBS and serum, which fitted various kinetics models, and was best fitted with Wagner log-probability model. The SHK mechanism of cellular toxicity, both as free drug and as nanoformulation, was studied in vitro and in vivo. SHK was found to cause apoptosis and necroptosis to all the cell lines studied. SHK was profoundly toxic in ovarian epithelial cancer cells (OVCAR-5 and ID8 cells) as well as in normal ovarian IOSE-398 cells, endothelial MS1 cells, epithelial TC1 cells and lymphocytes. SHK induced mitochondrial depolarization, formation of reactive oxygen species (ROS), autophagosomes, nuclei heterochromatin foci and DNA fragmentation in vitro. Fluorescence microscopy and flow cytometry analysis showed active interaction of Ab-armed NPs with TEM1-positive MS1 cells, but not with TEM1-negative MS1 cells, while exposure of lymphocytes to PEGylated NPs for 2 hours was not toxic. To address regulatory, clearance and toxicity issues, biodistribution studies were performed. NPs were not retained in liver/spleen and were excreted via urine track. Targeting efficacy in vivo was studied using the MS1 xenograft mouse model. SHK-loaded, 78Fc-armed NPs showed higher accumulation and killing efficiency at the TEM1-positive tumor site compared to free drug/unarmed NPs. TC1 murine lung carcinoma subcutaneous and intravenous/metastatic models were selected to evaluate efficiency in aggressive tumor models. In both models, 78Fc-armed NPs increased dramatically SHK cytotoxicity compared to unarmed NPs/free drug. TC1 subcutaneous model was studied in C57/BL6 mice. Accelerated blood clearance phenomenon was not observed and interestingly, the 78Fc-armed NPs had better therapeutic effect to C57/BL6 mice compared to naïve mice, suggesting potent synergism with the immune system. ELISPOT assay was performed to investigate specific immune response to E6/E7 antigens. Furthermore, mice that received the NPs treatment and became tumor free, were rechallenged with tumor cells to investigate specific immune response. The rechallenged mice remained tumor free 14 days after rechallenging. This observation implies that our targeted nanotherapeutic approach not only had a high efficacy but also stimulated a sustained immune response. Based upon all all our data, I SHK-loaded, anti-TEM1 Fc-armed PLGA NPs may be supposed as novel targeted therapy against TEM1 expressing carcinomas.

Ο καρκίνος είναι μια από τις κύριες αιτίες θανάτου ανά τον κόσμο και η επίπτωση του καρκίνου συνεχίζει να αυξάνεται παγκοσμίως, κυρίως εξαιτίας της γήρανσης του παγκόσμιου πληθυσμού. Η ανοχή στον κυτταρικό θάνατο και ο επαναπρογραμματισμός των μεταβολικών οδών είναι δύο από τα χαρακτηριστικά των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, καθώς και δύο κύριοι λόγοι της αναποτελεσματικότητας των χημειοθεραπειών. Κατά τη συμβατική χημειοθεραπεία, υψηλό ποσοστό των ασθενών είναι επιρρεπείς στην υψηλή τοξικότητα των φαρμάκων στα υγιή κύτταρα και ιστούς ενώ επίσης μεγάλο ποσοστό των ασθενών εμφανίζει ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία. Τα τελευταία χρόνια, έχει σημειωθεί σημαντική εξέλιξη στον τομέα της νανοτεχνολογίας και ιδιαιτέρως στις εφαρμογές της νανοτεχνολογίας στην ιατρική. Νανοσωματίδια, νανοσωλήνες και νανοικτριώματα χρησιμοποιούνται ευρέως στη μεταφορά φαρμάκων, σε εφαρμογές απεικόνισης για τη διάγνωση ασθενειών και στην ανάπτυξη ιστών ex vivo. Η μεταφορά χημειοθεραπευτικών φαρμάκων μπορεί να βελτιωθεί μέσω της χρήσης των νανοσωματιδίων, λόγω του φαινομένου ενισχυμένης διαπέρασης και κατακράτησης των νανοσωματιδίων από τους όγκους. Λόγω του φαινομένου αυτού, νανοσωματίδια μεγέθους < 200 nm κατακρατούνται παθητικά, επί το πλείστον, στην περιοχή των όγκων με συνέπεια την ενίσχυση της αποτελεσματικότητα των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων και ταυτόχρονα την μείωση της τοξικότητάς τους στους υγιής ιστούς. Είναι γεγονός πως προηγμένα νανοφάρμακα όπως το Doxil (λιποσωματίδια ντοξορουμπισίνης) έχουν αποδειχτεί πιο αποτελεσματικά από τη συμβατική χημειοθεραπεία. Ωστόσο, λόγω της ισχυρής τοξικότητας των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων ακόμη και μέσω της παθητικής νανομεταφοράς τους παρατηρούνται σημαντικές παρενέργειες στους ασθενείς. Η μάχη με τον καρκίνο μπορεί να ενισχυθεί συμβατικά, εάν η κυτταροτοξικότητα των φαρμάκων συνδυαστεί με την ανοσολογική απόκριση και μετέπειτα επιτήρηση ενάντια στα καρκινικά κύτταρα. Ανάμεσα στα φάρμακα που δοκιμάστικαν η σικονίνη αναδείχτηκε ως το πλέον υποσχόμενο. Η σικονίνη ως μικρό μόριο φαίνεται να έχει πολλαπλούς στόχους στα καρκινικά κύτταρα, ενώ έχει αποδειχτεί τοξική σε όλες τις καρκινικές σειρές που έχει χορηγηθεί έως τώρα. Επιπλέον, η σικονίνη έχει δειχτέι πως προκαλεί ανοσοαποκρισή και έχει χρησιμοποιηθεί σε εμβόλια ως ανοσοενισχυτικό. Ακόμη, έχει δειχτεί πως η σικονίνη είναι τοξική σε σειρές που έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα στα ευρέως χρησιμοποιούμενα χημειοθεραπευτικά, ενώ έως τώρα οι ερευνητές δεν έχουν καταφέρει να δημιουργήσουν κυτταρικές σειρές ανθεκτικές στο συγκεκριμένο φάρμακο. Στη συγκεκριμένη εργασία περιγράφεται η ανάπτυξη μίας πλατφόρμας για την στοχευμένη νανομεταφορά της σικονίνης στο μικροπεριβάλλον του όγκου, στοχεύοντας την ενδοσιαλίνη/καρκινικός ενδοθηλιακός δείκτης 1/ CD248. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν και κατασκευάστηκαν βιοσυμβατά και βιοδιασπόμενα νανοσωματίδια από πολυλάκτο-συν-γλυκολικό οξύ, γεμισμένα με σικονίνη, επικαλυμένα με πολυεθυλενογλυκόλη και με συσκευή στόχευσης έναντι του καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1 (ολικό αντίσωμα, τμήμα Fc του αντισώματος, τμήμα ScFv του αντισώματος έναντι του καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1). Με βάση την ανάλυση του σωματιδιακού μεγέθους και την ηλεκτονική μικροσκοπία, τα νανοσωματίδια που κατασκευάστηκαν είχαν λείο σφαιρικό σχήμα, εύρος μεγέθους 100-125nm και δυναμικό επιφανείας -30 έως -40mV. Η ικανότητα εγκλωβισμού του φαρμάκου και της βιοσύζευξης έφτασαν στο ~92% και ~90% αντίστοιχα. Η σικονίνη εμφάνισε προφίλ σταδιακής και παρατεταμένης απελευθέρωσης τόσο σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα όσο και σε εμβρυικό ορό. Το προφίλ απελευθέρωσης της σικονίνης φάνηκε πως προσαρμόζεται σε ποικίλα κινητικά μοντέλα, με καλύτερη προσαρμογή στο κινητικό μοντέλο Wagner log-probability. Γεγονός που φανερώνει πως η σικονίνη απελευθερώνεται από τα νανοσωματίδια κυρίως λόγω της βιοδιάσπασής τους και όχι μέσω διάχυσης ή κάποιου άλλου μηχανισμού. Ο μηχανισμός πρόκλησης κυτταρικού θανάτου της σικονίνης μελετήθηκε in vitro και in vivo, όπου και βρέθηκε να επιφέρει απόπτωση και νεκρόπτωση, σε όλες τις κυτταρικές σειρές/μοντέλα που μελετήθηκαν. Η σικονίνη ήταν εμβριθώς τοξική σε επιθηλιακές σειρές καρκίνου των ωοθηκών (OVCAR-5 και ID8) καθώς και σε φυσιολογικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών (IOSE-398), στις ενδοθηλιακές κυτταρικές σειρές MS1 και TC1 και σε λεμφοκύτταρα. Μετά από χορήγηση σικονίνης σε κυτταρικές σειρές παρατηρήθηκε πως η πλειονότητα του φαρμάκου συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ προκαλεί, μεταξύ άλλων, εκπόλωση των μιτοχονδρίων, παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS), αυτοφαγοσώματα, εστίες ετεροχρωματίνης στους πυρήνες των κυττάρων και κατακερματισμό του DNA in vitro. Η δραστική δόση (EC50) της σικονίνης μειώθηκε όταν χορηγληθηκε σε κυτταρικές σειρές υπό τη μορφή νανοσωματιδίων. Ενώ δραματική ήταν η πτώση της EC50 της σικονίνης όταν χορηγήθηκε σε υπό τη μοργή στοχευμένων νανοσωματιδίων σε κυτταρικές σειρές με υψηλή έκφραση του καρκινικού δείκτη 1. Όσον αφορά την ικανότητα στόχευσης in vitro των νανοσωματιδίων που έφεραν αντίσωμα έναντι του καρκινικού δείκτη 1, η ανάλυση των δεδομένων μικροσκοπίας φθορισμού και κυτταρομετρίας ροής έδειξε ενεργή αλληλεπίδραση των νανοσωματιδίων εξοπλισμένων με αντίσωμα και των MS1 κυττάρων με υψηλή έκραση καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1, αλλά όχι των MS1 κυττάρων χωρίς έκραση καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1. Επιπλέον, ενώ η χορήγηση της σικονίνης σε ελεύθερη μορφή ήταν τοξική, η χορήγηση νανοσωματιδίων σικονίνης δεν είχε τοξικά αποτελέσματα στα λεμφοκύτταρα. Μελέτη βιοκατανομής των νανοσωματιδίων έγινε προς διερεύνηση της τοξικότητας, της διασποράς και της κάθαρσης τους. Τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης έδειξαν πως τα συγκεκριμένα νανοσωματίδια δεν κατακρατούνται στο ήπαρ και στο σπλήνα, ενώ κυρίως εκκρίνονται μέσω του ουροποιητικού συστήματος μέσα σε 24 ώρες από τη χορήγησή τους. Ακόμη, τα άδεια νανοσωματίδια δεν είχαν άμεση τοξικότητα in vivo.Η αποτελεσματικότητα όσον αφορα την ικανότητα στόχευσης των νανοσωματιδίων in vivo μελετήθηκε αρχικά στο MS1 μοντέλο ξενομοσχεύματος σε ποντικούς. Τα νανοσωματίδια σικονίνης εξοπλισμένα με Fc έναντι του καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1 είχαν μεγαλύτερη συσσώρευση και τοξικότητα στην πλευρά του όγκου που εξέφραζε καρκινικό ενδοθηλιακό δείκτη 1, σε σύγκριση με τα μη εξοπλισμένα νανοσωματίδια/την ελεύθερη σικονίνη. Το μοντέλο μετάστασης TC1 μελετήθηκε σε nu/nu ποντικούς για να ελεγχθεί η αποτελεσματικότητα των νανοσωματιδίων σε ένα επιθετικό μοντέλο καρκίνου. Η ομάδα που υποβλήθηκε σε θεραπεία με νανοσωματίδια σικονίνης στοχευμένα ενάντια στον καρκινικό ενδοθηλιακό δείκτη 1 εμφάνιζαν ελάχιστες ή και καθόλου καρκινικές εστίες στους πνεύμονες σε αντίθεση με την ομάδα ελέγχου όπου όλη η επιφάνεια των πνευμόνων είχε καλυφθεί από καρκινικές εστίες. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν πως η στοχευμένη νανομεταφορά της σικονίνης σταματά την εισβολή και την εξάπλωση των καρκινικών κυτταρών. Προς απάντηση ερωτημάτων για την κάθαρση των νανοσωματιδίων από το αίμα αλλά και για την αλληλεπίδραση τους με το ανοσοποιητικό σύστημα, επιστρατεύτηκε το μοντέλο TC1 εξωμοσχευματος σε C57BL6 ποντικούς. Το φαινόμενο της ταχέως απομάκρυνσης από το αίμα δεν παρατηρήθηκε και τα νανοσωματίδια είχαν διακριτά καλύτερο θεραπευτικό αποτέλεσμα στα C57BL6 ποντίκια σε σχέση με τα nu/nu, υποδηλώνοντας εν δυμάμει συνέργεια της νανοθεραπείας με το ανοσοποιητικό σύστημα. Για να ερευνηθεί η ειδική ανοσολική απόκριση στα αντιγόνα Ε6/Ε7 των TC1 κυττάρων, πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία ELISPOT. Επιπλέον για τη διερεύνηση ειδικής ανοσολογικής απόκρισης in vivo στα ποντίκια που είχαν εξαληφθεί οι όγκοι μετά τη χορήγηση στοχευμένων νανοσωματιδίων, επανενέθηκαν τα ίδια καρκινικά κύτταρα χωρίς χορήγηση αντισωμάτων. Ο πληθυσμός των καρκινικών αυτών κυττάρων σταδιακά μειώθηκε και τελικά εξαλήφθηκε πλήρως. Το γεγονός αυτό φανερώνει πως η στοχευμένη νανομεταφορά της σικονίνης έχει όχι μόνο υψηλή θεραπευτική απόδοση αλλά και διεγείρει παρατεταμένη ανοσολογική απόκριση. Βασιζόμενη στo σύνολο των αποτελεσμάτων αυτής της μελέτης, τα PLGA νανοσωματίδια σικονίνης εξοπλισμένα με Fc έναντι του καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1 μπορούν να προταθούν ως καινοτόμος στοχευμένη θεραπεία για τα καρκινώματα με υψηλή έκφραση καρκινικού ενδοθηλιακού δείκτη 1.