Ο ρόλος παραγόντων μεταβολισμού mRNA στη γήρανση και τη φυσιολογία του νηματώδους C. elegans

Abstract

mRNA metabolism is a complicated process of eukaryotic cells, comprising of complex molecular events. During their life, mRNA transcripts interact with many proteins, forming ribonucleoprotein particles. The composition and remodeling of these particles determines the fate of mRNAs, driving processes such as maturation, nuclear export, translation, silencing and degradation. Especially mRNA decay plays an essential role in cell physiology, being necessary for the degradation of both normal transcripts that completed their life cycle and aberrant transcripts that could lead to the production of potentially toxic peptides. Moreover, fast stabilization or destabilization of specific transcripts serves as a means of rapid changes in gene expression in response to stimuli. A central role in the general mRNA degradation pathway, as well as in specialized cases e.g. miRNA dependent degradation, is performed by the decapping enzyme that removes the 5’ cap structure of mRNAs, rendering them susceptible to degradation by 5’→3’ exonucleases. In the nematode C. elegans the regulatory and catalytic subunits of the enzyme are encoded by dcap-1 and dcap-2 genes respectively. Loss of function mutations in these genes cause pleiotropic effects in organismal physiology, causing a delay in the rate of post-embryonic development and a significantly shorter lifespan. In the present work, mutations in dcap-1 and dcap-2 were found to impair the nematode’s ability to execute an alternative developmental program in response to high ambient temperature. This developmental program allows wild type animals to form dauer larvae that can survive for several months under adverse conditions and resume normal development when conditions improve. On the contrary, decapping mutants where found to arrest their development at an early larval stage, without obtaining any survival advantage. This developmental arrest is independent of the molecular pathways that control endocrine regulation of diapause, but correlates with an aberrant stabilization of lin-14 mRNA. In wild type animals, the expression of this heterochronic gene is drastically suppressed at the end of the first larval stage, through the action of lin-4 miRNA, allowing the transition to the second larval stage in favorable environments, or the formation of dauers under adverse conditions. The inability to effectively downregulate lin-14 in the nervous system was recognized as the molecular cause that leads to the developmental arrest of decapping mutants in high temperature, since this phenotype was suppressed by the neuron specific restoration of decapping function. This neuron specific restoration was also able to suppress the slow growth phenotype of decapping mutants in normal growth temperatures. Meanwhile, the mechanism of lin-14 downregulation was found to be ineffective in the nervous system of decapping mutants in normal growth temperatures, suggesting that the stabilization of lin-14 mRNA is the actual cause for their developmental defects in all temperatures. Additionally, studying the effect of tissue specific restoration of decapping function in lifespan revealed that dcap-1 overexpression in the nervous system leads to a significant delay in the rate of ageing, extending the nematode’s lifespan, while a similar but weaker effect was observed during overexpression of the gene in the intestine. Conversely, neuron specific silencing of dcap-1 and dcap-2 caused a significant decrease in the worm’s lifespan. This relationship between the expression levels of decapping genes and lifespan was found to be evolutionary conserved, since both overexpression and downregulation of dDcp1, homolog of dcap-1 in Drosophila melanogaster, were able to extend or shorten the fly’s lifespan respectively. The exploration of the mechanisms that mediate the longevity of worms overexpressing dcap-1 in their nervous system revealed that their phenotype is largely dependent on the action of DAF-16/FOXO transcription factor, effector of the Insulin/IGF-1 signaling pathway, in other tissues. The transduction of the longevity signal between tissues was found to be mediated, at least in part, by the expression levels of insulin like peptide INS-7. Moreover, silencing of LIN-14 transcription factor, which extends the lifespan of wild type animals, was found unable to further extend the lifespan of dcap-1 overexpressing animals, suggesting that its downregulation could contribute to their longevity. Combined with the observation that lin-14 expression levels increase during ageing, these data form a model according to which overexpression of dcap-1 in the nervous system leads to more effective silencing of lin-14, and possibly of additional miRNA target genes, leading to direct or indirect alterations in the expression levels of insulin like peptides. The expression levels of these peptides in their turn affect the function of the Insulin/IGF-1 signaling pathway systemically, inducing longevity. Overall the results of this work unveil the extreme importance of effective mRNA degradation during miRNA mediated gene silencing, while extending our knowledge concerning the contribution of the decapping enzyme in the regulation of complex biological processes, like development and ageing.

Ο μεταβολισμός των μορίων mRNA των ευκαρυωτικών κυττάρων αποτελεί μια πολύπλοκη διαδικασία, η οποία χαρακτηρίζεται από σύνθετα μοριακά γεγονότα. Κατά τη διάρκεια της ζωής τους τα μετάγραφα αλληλεπιδρούν με ένα πλήθος πρωτεϊνών, σχηματίζοντας ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα. Η σύσταση και η αναδιαμόρφωση των συμπλόκων αυτών καθορίζει ουσιαστικά την τύχη των mRNA, καθοδηγώντας διαδικασίες όπως η ωρίμανση, η έξοδος από τον πυρήνα, η μετάφραση, η αποσιώπηση και η αποικοδόμησή τους. Ιδιαίτερα ο καταβολισμός του mRNA κατέχει εξέχουσα σημασία στη φυσιολογία των κυττάρων, καθώς είναι απαραίτητος όχι μόνο για την αποικοδόμηση φυσιολογικών μετάγραφων που ολοκλήρωσαν τον κύκλο ζωής τους, αλλά και των ελαττωματικών που θα μπορούσαν να οδηγήσουν στην παραγωγή τοξικών πεπτιδίων. Επιπλέον, η γρήγορη σταθεροποίηση και αποσταθεροποίηση συγκεκριμένων μορίων mRNA, ως απόκριση σε ερεθίσματα, επιτρέπει την ταχεία ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης κάτω από μεταβαλλόμενες συνθήκες. Κεντρικό ρόλο στο γενικό μονοπάτι καταβολισμού των mRNA, αλλά και σε εξειδικευμένες υποπεριπτώσεις, όπως η επαγόμενη από miRNA αποικοδόμηση, διαδραματίζει το ένζυμο αφαίρεσης της καλύπτρας από το 5’ άκρο των μορίων, μια διαδικασία που καθιστά τα μετάγραφα ευαίσθητα στην αποικοδόμηση από εξωνουκλεάσες στην κατεύθυνση 5’→3’. Στο νηματώδη σκώληκα Caenorhabditis elegans η κωδικοποίηση της ρυθμιστικής και της καταλυτικής υπομονάδας του ενζύμου επιτελείται από τα γονίδια dcap-1 και dcap-2 αντίστοιχα. Μεταλλαγές στα γονίδια αυτά, που οδηγούν σε απώλεια λειτουργίας των προϊόντων τους, έχει βρεθεί ότι προκαλούν πλειοτροπικά αποτελέσματα στη φυσιολογία του οργανισμού, οδηγώντας, μεταξύ άλλων, στην εμφάνιση σημαντικής υστέρησης στο ρυθμό της μετα-εμβρυϊκής ανάπτυξης και ελάττωσης τη διάρκειας ζωής των ατόμων. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, οι μεταλλαγές στα γονίδια dcap-1 και dcap-2 βρέθηκαν να καταστέλλουν την ικανότητα του νηματώδους να εκτελέσει ένα εναλλακτικό αναπτυξιακό πρόγραμμα, ως προσαρμοστική απόκριση κατά την ανάπτυξή του σε περιβάλλον υψηλής θερμοκρασίας. Στα αγρίου τύπου άτομα, το εναλλακτικό αυτό πρόγραμμα επιτρέπει τη διάπαυση των ατόμων υπό τη μορφή προνυμφών dauer, οι οποίες μπορούν να επιβιώσουν για μήνες υπό δυσμενείς συνθήκες και να επανέλθουν στο φυσιολογικό μονοπάτι ανάπτυξης όταν βρεθούν σε ευνοϊκά περιβάλλοντα. Αντίθετα, η ανάπτυξη των μεταλλαγμάτων dcap-1 και dcap-2 υπό υψηλή θερμοκρασία βρέθηκε να αναστέλλεται μη αντιστρεπτά σε ένα νεαρό προνυμφικό στάδιο, χωρίς να προσφέρει κανένα πλεονέκτημα στην επιβίωση των ατόμων. Η αναστολή της ανάπτυξης των μεταλλαγμένων στελεχών βρέθηκε να συμβαίνει ανεξάρτητα από τη λειτουργία των ενδοκρινικών μονοπατιών που ρυθμίζουν φυσιολογικά τη διάπαυση, συσχετίστηκε όμως με μια αφύσική σταθεροποίηση των επίπεδων mRNA του ετεροχρονικού γονιδίου lin-14. Σε αγρίου τύπου άτομα, η έκφραση του γονιδίου αυτού μειώνεται δραστικά στο τέλος του πρώτου προνυμφικού σταδίου, μέσω της αποσιώπησής του από το miRNA lin-4, επιτρέποντας τη μετάβαση είτε στο δεύτερο προνυμφικό στάδιο, υπό ευνοϊκές συνθήκες, είτε στο στάδιο dauer σε δυσμενή περιβάλλοντα. Η αδυναμία επαρκούς μείωσης των επίπεδων mRNA του lin-14 στο νευρικό σύστημα του νηματώδους αναγνωρίστηκε ως η μοριακή αιτία που οδηγεί στην αναστολή της ανάπτυξης των μεταλλαγμένων ατόμων σε υψηλές θερμοκρασίες, καθώς αυτή μπορεί να κατασταλεί μέσω της νευροειδικής αποκατάστασης της λειτουργίας του ενζύμου αφαίρεσης της καλύπτρας. Αντίστοιχα, η μελέτη των φαινότυπων των μεταλλαγμένων ατόμων σε φυσιολογική θερμοκρασία αποκάλυψε ότι η υστέρηση που παρουσιάζουν στο ρυθμό της ανάπτυξης καταστέλλεται επίσης από την αποκατάσταση της λειτουργίας του ενζύμου στο νευρικό ιστό. Παράλληλα, ο μηχανισμός αποσιώπησης του lin-14 παρατηρήθηκε ότι χάνει τη αποτελεσματικότητά του στα μεταλλάγματα dcap-1 και dcap-2 και σε φυσιολογική θερμοκρασία, υποδεικνύοντας ότι η σταθεροποίηση των επιπέδων mRNA του lin-14 αποτελεί την αιτία εμφάνισης δυσλειτουργιών κατά την ανάπτυξη τους σε όλες τις θερμοκρασίες. Επιπλέον, η μελέτη της επίδραση της ιστοειδικής έκφρασης του γονιδίου dcap-1 στη μακροβιότητα αποκάλυψε ότι η υπερέκφρασή του στο νευρικό σύστημα οδηγεί σε μία σημαντική καθυστέρηση του ρυθμού γήρανσης και αύξηση της διάρκειας ζωής, ενώ μία αντίστοιχη, αλλά μικρότερης έντασης επίδραση παρατηρήθηκε και κατά την υπερέκφραση αποκλειστικά στο έντερο. Αντίθετα, η νευροειδική αποσιώπηση των γονιδίων dcap-1 και dcap-2 προκάλεσε σημαντική μείωση στη διάρκεια της ζωής. Παράλληλα, η σχέση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των συστατικών του ενζύμου αφαίρεσης της καλύπτρας και της μακροβιότητας βρέθηκε να μην περιορίζεται στον C. elegans, αλλά να είναι εξελικτικά συντηρημένη, καθώς τόσο η νευροειδική υπερέκφραση, όσο και η νευροειδική αποσιώπηση του γονιδίου dDcp1, ομόλογου του dcap-1 στη Drosophila melanogaster, βρέθηκαν να αυξάνουν ή να μειώνουν αντίστοιχα τη διάρκεια της ζωής της μύγας του ξυδιού. Η διερεύνηση των μηχανισμών που οδηγούν στη μακροβιότητα των διαγονιδιακών ατόμων του νηματώδους, που υπερεκφράζουν το γονίδιο dcap-1 στο νευρικό τους σύστημα, αποκάλυψε ότι αυτή εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη δράση του μεταγραφικού παράγοντα DAF-16/FOXO, τελεστή του μονοπατιού της ινσουλίνης, σε κύτταρα άλλων ιστών. Η μεταγωγή του σήματος μακροβιότητας μεταξύ των ιστών βρέθηκε να διαμεσολαβείται, τουλάχιστον εν μέρει, από τα επίπεδα έκφρασης του ινσουλινόμορφου πεπτιδίου INS-7. Επιπλέον, η αποσιώπηση του μεταγραφικού παράγοντα LIN-14, που αυξάνει τη διάρκεια ζωής των ατόμων αγρίου τύπου, βρέθηκε να μη δρα αθροιστικά στη μακροβιότητα των διαγονιδιακών ατόμων, εμπλέκοντας την ελάττωση της έκφρασής του στον υπεύθυνο μηχανισμό. Τα δεδομένα αυτά, σε συνδυασμό με την παρατήρηση ότι τα επίπεδα έκφρασης του lin-14 αυξάνονται κατά τη γήρανση, σκιαγραφούν ένα μοντέλο σύμφωνα με το οποίο η υπερέκφραση του dcap-1 στο νευρικό σύστημα οδηγεί σε αποτελεσματικότερη αποσιώπηση του γονιδίου lin-14, και πιθανώς επιπλέον γονιδίων που αποτελούν στόχους miRNA, προκαλώντας άμεσα ή έμμεσα την τροποποίηση των επιπέδων έκφρασης ινσουλινόμορφων πεπτιδίων. Τα πεπτίδια αυτά με τη σειρά τους επηρεάζουν τη λειτουργία του μονοπατιού της ινσουλίνης σε άλλα κύτταρα, επάγοντας συστημικά τη μακροβιότητα. Συνολικά, τα αποτελέσματα τις παρούσας διατριβής αποκαλύπτουν τη βαρύνουσα σημασία της επαρκούς αποικοδόμησης των μετάγραφων κατά την επαγόμενη από miRNA αποσιώπηση γονιδίων, ενώ παράλληλα εμβαθύνουν τη γνώση μας σχετικά με τη συμβολή του ενζύμου αφαίρεσης της καλύπτρας στη ρύθμιση πολύπλοκων βιολογικών διεργασιών, όπως η ανάπτυξη και η γήρανση.