Proteomic study of ovine mastitis associated with Mannheimia haemolytica

Abstract

Specific objectives of the present thesis were as follows: (i) the study of differentially expressed proteomes in ewes after experimentally induced Mannheimia haemolytica mammary infection and (ii) the study of the presence of cathelicidin-1 in milk as a diagnostic indicator for detection of subclinical mastitis in sheep, using infection models.The thesis is divided into three chapters followed by the General Discussion.In Chapter I, the relevant literature is reviewed. The Chapter is subdivided into two Parts. In Part A, the literature on methodologies in proteomics is briefly reviewed. In Part B, the literature in applied proteomics in veterinary science is presented.In Chapter II, after a brief review regarding M. haemolytica and its role in mastitis (Part A), an experiment detailing the proteomics analysis of blood and milk of ewes with induced M. haemolytica mammary infection is presented (Parts B and C).Mastitis was induced in lactating ewes (n=5) by deposition of a pathogenic M. haemolytica strain into the teat duct of ewes; the contralateral side of the udder was used as control. In order to confirm infection and to monitor progress of the disease, standard clinical, microbiological, cytological and histopathological methods were employed. Samples of blood (for plasma extraction) and milk (for whey extraction) were collected sequentially before and after challenge, in total, at 6 or 7 time-points per ewe up to 4th day post-challenge. For proteomics study, proteins were separated by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) for all samples. Differentially expressed proteins were detected semi-automatically in 2-DE gels. Spots were picked and the protein content was identified by using Matrix-assisted laser desorption/ionisation Time-of-flight mass spectrometre (MALDI-TOF MS). Animals developed mastitis, confirmed by isolation of the challenge strain and increase of cellular content (predominantly neutrophils) in milk and by histopathological evidence of leucocytic (neutrophils) infiltration with mammary epithelial destruction and intra-alveolar haemorrhages. In a protein reference map produced from a blood sample collected before inoculation, 19 proteins (in 155 spots) were identified; apart from serum albumin, apolipoprotein A-I, fibrinogen beta chain and haptoglobin were the predominant proteins on the gel; most (13/20) proteins were secreted and, in general, were involved in roles related to physiological functions in healthy animals (e.g., oxygen transport). In protein reference maps produced from two milk samples collected before inoculation, in total, 40 proteins (in totally 280 spots) were identified; apart from serum albumin, alpha-lactalbumin, alpha-S2-casein, beta-lactoglobulin-1/B and lactotransferrin were the predominant proteins on the gels; most (17/39) proteins were secreted and, in general, were involved in roles related to physiological functions in healthy animals. After challenge, in blood samples, 33 differentially expressed proteins were identified; of these, 6 were observed with downregulation, 13 with new expression (e.g., antithrombin-III, complement C3, complement factor B, complement C3, complement factor B) and 14 with fluctuating pattern (e.g., alpha-1-antiproteinase, apolipoprotein A-I, apolipoprotein A-IV, serotransferrin). In a protein reference map produced from one milk sample from inoculated side of the udder collected 12 h after inoculation, in total, 65 proteins (in 215 spots) were identified; apart from serum albumin, actin cytoplasmic 1, beta-lactoglobulin-1/B and cathelicidin-1 were the predominant proteins on the gels; most (19/65) proteins were secreted or cytoskeleton proteins, with fewer being cytoplasm proteins (18/65); they were involved in roles related to physiological functions or associated with the post-infection defence response in animals. After challenge, in milk samples, 89 differentially expressed proteins were identified; of these 18 were observed with downregulation, 53 with new expression – 3 with upregulation (e.g., alpha-enolase, apolipoprotein A-I, cathelicidin-1, haptoglobin, heat shock proteins, haemoglobins, protein S100-A9, phakinin) and 15 with fluctuating pattern (e.g., lactotransferrin, serotransferrin, transthyretin, tuftelin-interacting protein 11). Varying differential expression in samples from inoculated and non-inoculated side of the udder were recorded in 79 proteins (74 were differentially expressed only in samples from the inoculated side and 5 were differentially expressed only in samples from the non-inoculated side), whilst in 15 proteins differential expression was observed in samples from both sides of the udder. In total, 15 proteins (e.g., haptoglobin) showed status changes in both blood and milk of inoculated side of the udder after challenge. Regarding the biological process in which differentially expressed proteins were involved, in blood most proteins were involved in transport of ions and molecules (n=8) or in inflammatory and defence response (n=7); in milk from inoculated side, most were involved in cell organisation and biogenesis (n=17) or in inflammatory and defence response (n=13).In Chapter III, after a brief review regarding cathelicidins (Part A), detailed evaluation of findings related specifically to cathelicidin-1 obtained in the experiment described in Chapter II is presented (Part B). Then, the identification of cathelicidin-1 in milk of ewes with induced mammary infection is described (Part C). Finally, associations between results of cytological examinations and identification of cathelicidin-1 in milk of ewes are calculated (Part D).In Part B, detailed data regarding cathelicidin-1 identification, obtained during processing of milk samples in the experiment described in Chapter II is presented. Mean optical densities of cathelicidin-1 spots on 2-DE gels, obtained for each ewe, on each sampling point were calculated. Spots representing cathelicidin-1 were matched across gels obtained from samples collected from the same ewe throughout the study. Subsequently, means were calculated for results obtained for each animal on each sampling point. Presence of cathelicidin-1 in milk was not evident before inoculation of ewes. After challenge, the protein was recorded in samples from 5/5 ewes (19/22 samples) from the inoculated side of the udder, starting 12 h (D0+12 h) after inoculation, as well as in 3/5 ewes (5/22 samples) from the contralateral side of the udder, starting on the 1st day after inoculation. In milk samples from the inoculated side of the udder of all ewes, spot density of cathelicidin-1 increased sharply, starting at the first post-inoculation sampling (D0+12 h) and progressively decreased thereafter (P=0.001), with differences between results of inoculated and non-inoculated glands being significant (P=0.05).In Part C, mastitis was induced by intramammary inoculation of M. haemolytica or Staphylococcus chromogenes in ewes (n=3); the contralateral side of the udder was used as control. In order to confirm infection and to monitor progress of the disease, standard clinical, microbiological and cytological methods were employed. Samples of milk (for whey extraction) were collected sequentially before and after challenge and until 24 h after that. For proteomics study, proteins were separated by 2-DE for all samples. Cathelicidin-1 was identified semi-automatically in 2-DE gels. Spots were picked and the protein content was identified by using MALDI-TOF MS. Animals developed mastitis, confirmed by isolation of the challenge strain and increase of cellular content (predominantly neutrophils) in milk samples. Presence of cathelicidin in milk was not evident before inoculation of ewes. After challenge, it was recorded in samples from 3/3 ewes (14/15 samples) from the inoculated side of the udder, starting 3 h after inoculation, but from no sample from the contralateral side of the udder. In milk samples from the inoculated side of the udder of all ewes, spot density of cathelicidin-1 increased sharply, starting at the first post-inoculation sampling (3 h after inoculation) and progressively increased further until 12 h after inoculation (P=0.002), with differences between results of inoculated and non-inoculated glands being significant (P=0.05).In part D, computations are performed to evaluate correlation between California Mastitis Test (CMT) scores or somatic cell counts and optical densities of cathelicidin-1 in milk samples. For calculations, results obtained from each ewe on the respective occasion were considered. Analysis of correlation, with results considered as ‘negative’ or ‘positive’, was also performed. Results of both experiments were considered together. There was significant correlation between cellular content and cathelicidin-1 spot densities in milk samples (P<0.001). Sensitivity / Specificity of using detection of cathelicidin-1 for diagnosis of mastitis was 0.965 / 0.815, respectively, with positive predictive value / negative predictive value being 0.685 / 0.980.The conclusions from the results of the present thesis are summarised herebelow.(a) The proteome of blood and milk of ewes with mastitis associated with Mannheimia haemolytica has been studied, for identification and evaluation of changes in protein expression, interactions or modifications as the result of mastitis. The findings confirmed the complex interactions between mediators, leucocytes, mammary cells and lacteal secretions that took place during acute inflammatory reaction in mastitis. The entirety of proteomics findings has indicated that affected ewes had mounted a defence response that had been regulated by many proteins and through various pathways; these were interdependent at various points. The results have indicated that already 12 hours subsequently to bacterial deposition into the teat duct, new expression and/or upregulation of increased number of proteins was evident, primarily in milk and to a lesser degree in blood. Of the proteins observed with new expression or upregulation in milk, some were of blood origin, some were released by blood constituents that entered into the mammary gland (e.g., by neutrophils) and some were locally synthesized in the mammary gland. It may be postulated that ewes attempted to continue milk synthesis and production, as well as accommodating the increased needs for leucocytic activities. There were indications that various proteins might be of value as biomarkers for ovine mastitis.(b) Detection of cathelicidin-1 in milk has been associated with increased sensitivity and specificity in diagnosis of mastitis. There was an increased correlation of presence of cathelicidin-1 with results of cytological examination; similar findings were recorded when cytological results were taken into account as either quantitative (numerical values) or qualitative (positive/negative) results. Cathelicidin-1 was detected in milk earlier than increased cellular content. When used for diagnosis of mastitis, cathelicidin-1 has the advantage that, as it is not present in milk of healthy ewes, there would be no need to establish a threshold, hence a ‘positive’/’negative’ assessment would suffice.

Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στην πρωτεωμική μελέτη της πειραματικής μαστίτιδας από Mannheimia haemolytica σε πρόβατα, χρησιμοποιώντας καθιερωμένα πρότυπα πειραματικής μόλυνσης, και αποσκοπεί ειδικότερα: (α) στη μελέτη της διαφορικής έκφρασης πρωτεϊνών επακόλουθα της πρόκλησης μαστίτιδας από M. haemolytica σε προβατίνες και (β) στην αξιολόγηση της σημασίας της καθελισιδίνης-1 στο γάλα των προβατίνων ως διαγνωστικό μέσο για την ανίχνευση της υποκλινικής μαστίτιδας.Η διατριβή χωρίζεται σε τρία κεφάλαια και ακολουθεί η Γενική Συζήτηση.Στο Κεφάλαιο Ι, ανασκοπείται η σχετική βιβλιογραφία. Το Κεφάλαιο υποδιαιρείται σε δύο τμήματα. Στο τμήμα Α, ανασκοπείται συνοπτικά η βιβλιογραφία σχετικά με την πρωτεωμική τεχνολογία και τις μεθοδολογίες που ακολουθούνται. Στο τμήμα Β ανασκοπείται η βιβλιογραφία η σχετική με την εφαρμογή της πρωτεωμικής στην κτηνιατρική επιστήμη.Στο Κεφάλαιο II, μετά από σύντομη ανασκόπηση για το βακτήριο M. haemolytica και το ρόλο του στη μαστίτιδα (τμήμα Α), περιγράφεται ένας πειραματισμός, στον οποίο πραγματοποιήθηκε πρωτεωμική ανάλυση του αίματος και του γάλακτος προβατίνων έπειτα από ενοφθαλμισμό του μαστού με M. haemolytica (τμήματα Β και Γ).Προκλήθηκε μαστίτιδα σε προβατίνες (n=5) στη γαλακτική περίοδο με ενοφθαλμισμό ενός στελέχους M. haemolytica με γνωστή παθογόνο δράση εντός του θηλαίου πόρου του μαστού, η δε ετερόπλευρη πλευρά του μαστού χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Για επιβεβαίωση της εκδήλωσης μαστίτιδας και για παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου, χρησιμοποιήθηκαν καθιερωμένες κλινικές, μικροβιολογικές, κυτταρολογικές και ιστοπαθολογικές τεχνικές. Δείγματα αίματος (για εξαγωγή πλάσματος) και γάλακτος (για εξαγωγή ορού γάλακτος) συλλέχθηκαν διαδοχικά πριν από και μετά τον ενοφθαλμισμό, συνολικά σε 6 ή 7 χρονικά σημεία ανά προβατίνα μέχρι την 4η ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό. Για την πρωτεωμική ανάλυση, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πηκτώματος πολυακριλαμιδίου σε όλα τα δείγματα και στα πηκτώματα ανιχνεύτηκαν οι διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες. Επιλέχθηκαν οι κηλίδες πρωτεϊνών στα πηκτώματα και οι πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας, χρησιμοποιώντας ιοντισμό-εκρόφηση από μήτρα μέσω laser σε συνδυασμό με αναλυτή μαζών χρόνου πτήσης (MALDI-TOF MS). Όλα τα ζώα στον πειραματισμό εκδήλωσαν μαστίτιδα, η οποία επιβεβαιώθηκε με βάση την απομόνωση του ενοφθαλμισμένου στελέχους και την αύξηση των σωματικών κυττάρων (κυρίως ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα) στο γάλα, καθώς και με τα ιστοπαθολογικά ευρήματα της παρουσίας λευκοκυτταρικής (ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα) διήθησης, με καταστροφή του μαστικού επιθηλίου και διακυψελιδική αιμορραγία. Σε πρωτεωμικό χάρτη αναφοράς που παράχθηκε από δείγμα αίματος, που είχε συλλεχθεί πριν από τον ενοφθαλμισμό, ταυτοποιήθηκαν 19 πρωτεΐνες (σε 155 κηλίδες). Εκτός από την αλβουμίνη ορού, οι κυριότερες ταυτοποιηθείσες πρωτεΐνες ήταν η απολιποτρωτεΐνη Α-Ι, η β-αλυσίδα ινοδωγόνου και η απτογλοβίνη - οι περισσότερες (13/20) ήταν εκκρινόμενες πρωτεΐνες, σχετίζονταν δε με φυσιολογικές λειτουργίες στα ζώα (π.χ., μεταφορά οξυγόνου). Σε πρωτεωμικούς χάρτες αναφοράς που παράχθηκαν από δύο δείγματα γάλακτος, που είχαν συλλεχθεί πριν από τον ενοφθαλμισμό, ταυτοποιήθηκαν συνολικά 40 πρωτεΐνες (σε συνολικά 280 κηλίδες). Εκτός από την αλβουμίνη ορού, οι κυριότερες ταυτοποιηθείσες πρωτεΐνες ήταν η α-λακταλβουμίνη, η α-S2-καζεΐνη, η β-λακτογλοβουλίνη και η λακτοτρανφερίνη - οι περισσότερες (17/39) ήταν εκκρινόμενες πρωτεΐνες, σχετίζονταν δε με φυσιολογικές λειτουργίες στα ζώα. Μετά τον ενοφθαλμισμό, στα δείγματα αίματος, ταυτοποιήθηκαν 33 διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες, από τις οποίες 6 υποεκφράστηκαν, 13 εκφράστηκαν εξαρχής (π.χ., αντιθρομβίνη-ΙΙΙ, συμπλήρωμα C3, παράγοντας συμπληρώματος Β) και 14 παρουσίασαν διακυμάνσεις στην έκφραση (π.χ., άλφα-1-αντιπρωτεϊνάση, απολιποπρωτεΐνη Α-1, απολιποπρωτεΐνη Α-IV, σεροτρανσφερίνη). Σε πρωτεωμικό χάρτη αναφοράς που παράχθηκε από δείγμα γάλακτος, που είχε συλλεχθεί από την ενοφθαλμισμένη μεριά του μαστού 12 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό, ταυτοποιήθηκαν 65 πρωτεΐνες (σε 215 κηλίδες). Εκτός από την αλβουμίνη ορού, οι κυριότερες ταυτοποιηθείσες πρωτεΐνες ήταν η κυτταροπλασματική ακτίνη-1, η β-λακτογλοβουλίνη-1/Β και η καθελισιδίνη-1 - οι περισσότερες (19/65) ήταν εκκρινόμενες πρωτεΐνες ή πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού και λιγότερες (18/65) ήταν πρωτεΐνες του κυτταροπλάσματος, οι οποίες, σχετίζονταν με φυσιολογικές λειτουργίες σε ζώα ή με την αμυντική ανταπόκριση μετά από μόλυνση. Μετά τον ενοφθαλμισμό, στα δείγματα γάλακτος, ταυτοποιήθηκαν 89 διαφορικά εκφρασμένες πρωτεΐνες, από τις οποίες 18 υποεκφράστηκαν, 53 εκφράστηκαν εξαρχής - 3 υπερεκφράστηκαν (π.χ., άλφα-ενολάση, απολιποπρωτεΐνη Α-1, καθελισιδίνη-1, απτογλοβίνη, heat-shock proteins, πρωτεΐνη S100-A9, phakinin) και 15 παρουσίασαν διακυμάνσεις στην έκφραση (π.χ., λακτοτρανσφερίνη, σεροτρανσφερίνη, τρανσθυρετίνη, tuftelin-interacting protein 11). Σε 79 πρωτεΐνες, ταυτοποιήθηκαν διαφορές στη διαφορική έκφρασή τους μεταξύ ενοφθαλμισμένης και μη ενοφθαλμισμένης πλευράς του μαστού (74 σε δείγματα από την ενοφθαλμισμένη πλευρά και 5 σε δείγματα από τη μη ενοφθαλμισμένη πλευρά του μαστού), ενώ σε 15 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν διαφορές στη διαφορική έκφρασή τους και στις δύο πλευρές του μαστού. Επίσης, 15 πρωτεΐνες (π.χ., απτογλοβίνη) εμφάνισαν διαφορική έκφραση ταυτόχρονα σε αίμα και γάλα μετά τον ενοφθαλμισμό. Σχετικά με την βιολογική διεργασία στην οποία συμμετείχαν οι πρωτεΐνες που παρουσίασαν διαφορική έκφραση, στο μεν αίμα οι περισσότερες πρωτεΐνες συμμετείχαν στη μεταφορά ιόντων και μορίων (n=8) ή στην αμυντική απάντηση (n=7), στο δε γάλα οι περισσότερες πρωτεΐνες συμμετείχαν στην κυτταρική οργάνωση (n=17) ή στην αμυντική απάντηση (n=13).Στο Κεφάλαιο III, μετά από σύντομη ανασκόπηση για τις καθελισιδίνες (τμήμα Α), παρουσιάζεται λεπτομερής αξιολόγηση των ευρημάτων που σχετίζονται ειδικά με την καθελισιδίνη-1 από τον πειραματισμό για την πρωτεωμική ανάλυση του αίματος και του γάλακτος προβατίνων σε περιπτώσεις μαστίτιδας από M. haemolytica, που έχει περιγραφεί στο Κεφάλαιο ΙΙ (τμήμα Β). Στη συνέχεια, περιγράφεται επιπλέον πειραματισμός για τον προσδιορισμό της καθελισιδίνης-1 σε γάλα προβατίνων μετά από ενδομαστικό ενοφθαλμισμό και πρόκληση μαστίτιδας (τμήμα Γ). Τέλος, υπολογίζονται συσχετίσεις μεταξύ των αποτελεσμάτων των κυτταρολογικών εξετάσεων και της ταυτοποίησης της καθελισιδίνης-1 στο γάλα των προβατίνων (τμήμα Δ).Στο Τμήμα Β, έγινε λεπτομερής αξιολόγηση των στοιχείων σχετικά με την ταυτοποίηση της καθελισιδίνης-1 στα δείγματα γάλακτος στον πειραματισμό που παρουσιάζεται στο Κεφάλαιο ΙΙ. Στο πλαίσιο αυτό, υπολογίστηκαν οι μέσες τιμές της οπτικής πυκνότητας των κηλίδων της καθελισιδίνης-1 στα πηκτώματα, για κάθε ζώο και κάθε χρονικό σημείο δειγματοληψίας. Κηλίδες αντιπροσωπευτικές της καθελισιδίνης-1 αντιστοιχήθηκαν στα πηκτώματα από τα δείγματα από κάθε ζώο για όλα τα συλλεχθέντα δείγματα. Στη συνέχεια, υπολογίστηκαν οι μέσες τιμές οπτικής πυκνότητας σε κάθε πήκτωμα. Δεν εντοπίστηκε καθελισιδίνη-1 στο γάλα πριν από τον ενοφθαλισμό. Μετά τον ενοφθαλμισμό, καθελισιδίνη-1 ταυτοποιήθηκε σε δείγματα γάλακτος από την ενοφθαλμισμένη πλευρά του μαστού από τις 5/5 προβατίνες (συνολικά σε 19/22 δείγματα) για πρώτη φορά 12 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό, καθώς και σε δείγματα από τη μη ενοφθαλμισμένη πλευρά από 3/5 προβατίνες (συνολικά σε 5/22 δείγματα) για πρώτη φορά την 1η ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό. Στα δείγματα γάλακτος από την ενοφθαλμισμένη πλευρά του μαστού, η οπτική πυκνότητα των κηλίδων της καθελισιδίνης-1 αυξήθηκε δραματικά ήδη στην πρώτη δειγματοληψία μετά τη μόλυνση (D0+12 ώρες) και στη συνέχεια μειώθηκε προοδευτικά (P=0,001 σε σχέση με την τιμή πριν από τον ενοφθαλμισμό), επιπλέον δε οι διαφορές στα ευρήματα από την ενοφθαλμισμένη και τη μη ενοφθαλμισμένη πλευρά του μαστού ήταν σημαντικές (P=0,05).Στο Τμήμα Γ, παρουσιάζεται ένας πειραματισμός, στον οποίο πραγματοποιήθηκε ενδομαστικός ενοφθαλμισμός M. haemolytica ή Staphylococcus chromogenes σε προβατίνες (n=3), ο δε ετερόπλευρος μαστικός αδένας χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Για επιβεβαίωση της ανάπτυξης μαστίτιδας και για παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου, χρησιμοποιήθηκαν κλινικές, μικροβιολογικές και κυτταρολογικές μέθοδοι. Δείγματα γάλακτος (για παραγωγή ορού γάλακτος) συλλέχθηκαν διαδοχικά πριν από και μετά τον ενοφθαλμισμό, συνολικά σε 5 χρονικά σημεία ανά προβατίνα μέχρι 24 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό. Για την πρωτεωμική ανάλυση, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση πηκτώματος πολυακριλαμιδίου σε όλα τα δείγματα. Στα πηκτώματα, ανιχνεύτηκε και ταυτοποιήθηκε η καθελισιδίνη-1. Επιλέχθηκαν στα πηκτώματα οι αντιπροσωπευτικές της καθελισιδίνης-1 κηλίδες και η πρωτεΐνη ταυτοποιήθηκε με φασματομετρία μάζας, χρησιμοποιώντας τον φασματογράφο MALDI-TOF MS. Όλα τα ζώα στον πειραματισμό εκδήλωσαν μαστίτιδα, η οποία επιβεβαιώθηκε με βάση την απομόνωση του ενοφθαλμισμένου στελέχους και την αύξηση των σωματικών κυττάρων (κυρίως ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα) στο γάλα. Δεν ταυτοποιήθηκε καθελισιδίνη-1 στο γάλα πριν από τον ενοφθαλισμό των προβατίνων. Μετά τον ενοφθαλμισμό, η πρωτεΐνη ταυτοποιήθηκε στο γάλα και των τριών προβατίνων (συνολικά σε 14/15 δείγματα) από τον ενοφθαλμισμένο μαστικό αδένα για πρώτη φορά 3 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό, αλλά δεν ταυτοποιήθηκε σε κανένα δείγμα από τον ετερόπλευρο μαστικό αδένα. Η μέση τιμή της οπτικής πυκνότητας των κηλίδων της πρωτεΐνης αυξήθηκε, ήδη στο πρώτο μετά τον ενοφθαλμισμό δείγμα (3 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό), και έφτασε στη μέγιστη τιμή 12 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό (P=0,002 σε σχέση με τις τιμές πριν από τον ενοφθαλμισμό), επιπλέον δε οι διαφορές στα ευρήματα από την ενοφθαλμισμένη και τη μη ενοφθαλμισμένη πλευρά του μαστού ήταν σημαντικές (P=0,05).Στο Τμήμα Δ, πραγματοποιήθηκαν υπολογισμοί και ανάλυση για διερεύνηση ενδεχόμενης συσχέτισης των τιμών της δοκιμής California Mastitis Test (CMT) ή του αριθμού των σωματικών κυττάρων με τις τιμές οπτικής πυκνότητας της καθελισιδίνης-1. Για την ανάλυση, οι διάφοροι υπολογισμοί έγιναν θεωρώντας κάθε δείγμα από κάποιο ζώο ως μία παρατήρηση και έλαβε χώρα συσχέτιση αριθμητικών τιμών. Πραγματοποιήθηκε επιπλέον ανάλυση, στην οποία τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν ως ‘αρνητικά’ ή ‘θετικά’ και έγινε η κατάλληλη συσχέτιση. Τα αποτελέσματα των δύο πειραματισμών συγκεντρώθηκαν και αναλύθηκαν συνολικά. Παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ του κυτταρικού περιεχομένου και της οπτικής πυκνότητας των κηλίδων καθελισιδίνης-1 στα δείγματα γάλακτος (P<0.001). Η ευασθησία / ειδικότητα της χρήσης καθελισιδίνης-1 για τη διάγνωση της μαστίτιδας ήταν 0,965 / 0,815, αντίστοιχα, ο δε θετικός προγνωστικός δείκτης / αρνητικός προγνωστικός δείκτης αυτής ήταν 0,685 / 0,980, αντίστοιχα.Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από τα ευρήματα αυτής της διατριβής, είναι τα παρακάτω.(α) Μελετήθηκε το πρωτέωμα του αίματος και του γάλακτος σε προβατίνες με μαστίτιδα από Mannheimia haemolytica, για ταυτοποίηση και αξιολόγηση των μεταβολών στην έκφραση των πρωτεϊνών, των αλληλεπιδράσεων μεταξύ τους και των διαφοροποιήσεών τους ως αποτέλεσμα της μαστίτιδας. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την πολυπλοκότητα μεταξύ μεσολαβητών, λευκοκυττάρων, μαστικών επιθηλιακών κυττάρων και των εκκρίσεων του μαστικού αδένα κατά την οξεία φάση της λοίμωξης. Το σύνολο των πρωτεωμικών ευρημάτων έδειξε ότι η ανοσολογική ανταπόκριση στις προσβεβλημένες προβατίνες εξαρτάτο από πολλές πρωτεΐνες και εκδηλωνόταν μέσω διαφόρων μονοπατιών, παρατηρήθηκαν δε πολλές αλληλεπιδράσεις μεταξύ τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ήδη 12 ώρες μετά την εναπόθεση βακτηρίων στο θηλαίο πόρο, υπήρξε εξαρχής έκφραση ή υπερέκφραση πολλών πρωτεϊνών, κυρίως στο γάλα και σε μικρότερο βαθμό στο αίμα. Από τις πρωτεΐνες στις οποίες παρατηρήθηκε εξαρχής έκφραση ή/και υπερέκφραση, ορισμένες προέρχονταν από το αίμα, ορισμένες απελευθερώθηκαν από συστατικά του αίματος που εισήλθαν στο μαστικό αδένα (π.χ., από ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα) και ορισμένες συνετέθησαν τοπικά στο μαστικό ιστό. Θεωρήθηκε ότι οι προβατίνες προσπαθούσαν να διατηρούσαν την σύνθεση και παραγωγή γάλακτος, ταυτοχρόνως δε να εξυπηρετούσαν τις ανάγκες για ανοσολογική ανταπόκριση και λευκοκυτταρική δραστηριότητα. Υπήρχαν ενδείξεις ότι αρκετές πρωτεΐνες θα μπορούσαν να χρησιμοποιούνταν ως βιοδείκτες για τη μαστίτιδα στις προβατίνες.(β) Η ανίχνευση καθελισιδίνης-1 στο γάλα συσχετίστηκε με αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα στη διάγνωση της μαστίτιδας. Υπήρχε αυξημένη συσχέτιση της παρουσίας της καθεσιδίνης-1 με τα αποτελέσματα της κυτταρολογικής εξέτασης, τα αποτελέσματα δε ήταν παρόμοια όταν τα ευρήματά της ελήφθησαν υπόψη ως ποσοτικά (αριθμητικές τιμές) ή ποιοτικά (‘θετικά’/‘αρνητικά’) αποτελέσματα. Η καθελισιδίνη-1 ανιχνεύτηκε στο γάλα πιο νωρίς από την αύξηση του αριθμού των σωματικών κυττάρων. Η ανίχνευση της καθελισιδίνης-1 για την διάγνωση της μαστίτιδας έχει το πλεονέκτημα ότι, καθώς δεν ανιχνεύεται στο γάλα των υγιών προβατίνων, δεν υπάρχει ανάγκη να καθιερωθεί ουδός για την τιμή της, αλλά θα αρκούσε μία αξιολόγηση ‘θετικό’/‘αρνητικό’.