Ανοσοϊστοχημική μελέτη του αυξητικού χόνδρου σε οστεοχονδροδυσπλασίες και φυσιολογικά οστά κατά την εμβρυϊκή και περιγεννητική ηλικία

Abstract

IntroductionSkeletal dysplasias are a clinically and genetically heterogenous group of malformations concerning the bones and/or cartilage. Their clinical presentation varies from mild growth retardation of postnatal death. Although skeletal dysplasias are individually rare, collectively they make up a large group of disorders. Their molecular background is complex and is being studied intensively. Studies with animal models have implicated, among others, Insulin-like Growth Factor (IGF)-1 and Growth Hormone (GH) in the longitudinal bone growth during both the embryonic and neonatal period. However, their potential role in skeletal dysplasias has not been elucidated yet.AimThe aim of the present study was to investigate the immunohistochemical expression of IGF-1 and GH in the long bones of 3 groups fetuses: Fetuses with normal longitudinal bone growth, fetuses suffering from genetic skeletal disorders which affect the longitudinal bone growth and fetuses with intrauterine growth retardation (IUGR) of genetic or other cause, in order to establish whether IGF-1 and GF are implicated in the long bone growth disorders of any cause. Materials and MethodsImmunohistochemistry was performed on paraffin-embedded tissue specimens from long bones (femoral head and, in cases, tibial as well) of 23 fetuses with normal growth, 29 fetuses suffering from genetic skeletal disorders and 24 fetuses with IUGR to detect the proteins IGF-1 and GH. Statistic analysis was based on parametric and non parametric methods.ResultsGH was not immunodetected in the cartilage of the growth plate. On the contrary, IGF-1 was immunodetected in the chordrocytes of both the calm and proliferative zone, as well as in osteoblasts, osteoclasts and bone marrow cells. IGF-1 immunoexpressions in the various zones of the cartilage were positively correlated with each other within each one of the groups we studied. On the contrary, IGF-1 immunostaining was inversely correlated with the gestational age in the control and the IUGR groups. Moreover, IGF-1 immunoexpression was found to be statistically different between the groups. Specifically, the most intense IGF-1 immunodetection was found in the healthy fetuses, the IUGR group depicted less intense immunoexpression, while the skeletal dysplasias had the least intense labeling. Taking into consideration the gestational age as well, IGF-1 immunoexpression was found to be significantly different in the 1st and 2nd trimester in the proliferative zone, in perivascu150 lar areas and in the total cartilage. Regarding the subgroups of genetic skeletal disorders, IGF-1 immunostaining was found to be significantly higher in osteogenesis imperfect in sub-perichondral and perivascular areas. No correlation was found between IGF-1 and the patients’ sex, the lethality of the disorder and the histological appearance of the cartilage.DiscussionIn the present study, IGF-1 was immunodetected in all cartilage zones, as well as in the chondrocytes of the perichondrium, osteoblasts, osteoclasts and bone marrow cells. This immunolocalization has never been described before in human fetuses, while findings from animal models are controversial. To our knowledge, this is the first study to report an inverse correlation between IGF- 1 immunoexpression in the cartilage and gestational age within both the control and IUGR groups. This finding agrees with experimental data from animal models. In the groups of skeletal dysplasias, the inverse trend between IGF-1 and gestational age was not statistically significant, possibly because IGF-1 immunoexpression is too low, already from the 1st trimester, to show statistically significant correlations. The fact that IGF-1 immunostaining was found to be more intense in the control group than in the skeletal dysplasias and IUGR supports the pivotal role of IGF-1 in the linear bone growth. Morevover, the statistically significant difference in the IGF-1 immunoexpression only in the growth plate between the control group and the dysplasias, control group and IUGR and between dysplasias and IUGR, depicts the importance of the IGF-1 action in that particular zone. With regard to the IGF-1 immunoexpression in the three groups in relation to the trimesters, we found significant difference in the IGF-1 immunoepxression in the growth plate, which was not present in the calm zone. The aforementioned differences were found during the 1st and 2nd trimesters when the fetal development is quicker and more intense while they were not present during the 3d trimester. In the present study, the most frequent skeletal disorder was that of thanatophoric dysplasia type 1, which belongs to the group of FGFR-3 mutations. FGFR-3 is mainly expressed in the growth plate, which agrees with our previously reported findings. The difference in the IGF-1 expression in the subperichondrial and perivascular regions in the subgroup of the osteogenesis imperfect in relation to the rest subgroups, where it was lower, could possibly be attributed to the fact that osteogenesis imperfecta is a disorder characterized by decreased bone mineralization due to mutations in the gene of the collagen 1α1. In other words, the linear bone growth is intact but the limb ends up shortened due to fractures and deformities. Concluding, especially in healthy fetuses and to a lesser extent in the fetuses suffering from skeletal disorders and those with IUGR, the local expression of IGF-1 in the cartilage of the humerus bone is being decreased in relation with gestational age. IGF-1 immunoexpression in healthy fetuses was found to be significantly higher than both fetuses with skeletal dysplasias or IUGR, which depicts its pivotal role in linear bone growth. The fact that the most intense difference in the IGF-1 expression between control group and the two other groups was observed in the growth plate agrees with the important role of the growth plate in the longitudinal bone growth.

Οι σκελετικές δυσπλασίες αποτελούν μια κλινικά και γενετικά ετερογενή ομάδα διαταραχών των οστών ή / και του χόνδρου. Οι κλινικές τους εκδηλώσεις ποικίλλουν και καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα, από την ήπια καθυστέρηση στην αύξηση έως το νεογνικό θάνατο. Παρόλο που ως μεμονωμένες διαταραχές είναι σπάνιες, στο σύνολό τους αποτελούν μια μεγάλη ομάδα παθήσεων. Το μοριακό υπόβαθρο των σκελετικών δυσπλασιών είναι πολύπλοκο και διερευνάται συνεχώς. Πειραματικά δεδομένα σε ζωικά πρότυπα εμπλέκουν μεταξύ άλλων παραγόντων και τον αυξητικό παράγοντα του τύπου της ινσουλίνης (IGF) -1 και την αυξητική ορμόνη (GH), στην κατά μήκος αύξηση των οστών, τόσο στην εμβρυϊκή, όσο και νεογνική ηλικία. Ωστόσο, η πιθανός ρόλος του στις σκελετικές δυσπλασίες δεν έχει διερευνηθεί. Σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης των παραγόντων IGF-1 και GH στα μακρά οστά του ανθρώπινου εμβρύου με φυσιολογική κατά μήκος αύξηση κατά τη διάρκεια της κύησης, εμβρύων πασχόντων από γενετική σκελετική δυσπλασία που προκαλεί διαταραχή της κατά μήκος αύξησης των οστών και σε περιπτώσεις εμβρύων που παρουσιάζουν ενδομήτρια καθυστέρηση της αύξησης (ε.κ.α.) γενετικής ή μη αιτιολογίας προκειμένου να διαπιστωθεί κατά πόσον οι ανωτέρω παράγοντες συμμετέχουν στη διαταραχή της αύξησης των μακρών οστών ποικίλης αιτιολογίας.Το υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 23 περιστατικά φυσιολογικών εμβρύων, 29 περιστατικά πασχόντων από γενετικές σκελετικές δυσπλασίες και 24 περιστατικά με ε.κ.α. Από κάθε περιστατικό ελήφθη δείγμα μακρού οστού και συγκεκριμένα από την κεφαλή του μηριαίου οστού και, κατά περιπτώσεις, και από την κνήμη, το οποίο επεξεργάστηκε και εγκλείσθηκε σε κύβους παραφίνης. Από τους τελευταίους ελήφθησαν τομές για ιστολογική εξέταση και ανοσοϊστοχημικές χρώσεις με αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών του IGF-1 και GH. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με παραμετρικές και μη παραμετρικές στατιστικές μεθόδους.Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης, η αυξητική ορμόνη δεν εντοπίστηκε ανοσοϊστοχημικά στο χόνδρο της αρθρικής επιφάνειας του οστού. Αντίθετα, ο IGF-1 εντοπίστηκε στα χονδροκύτταρα τόσο του εν ηρεμία, όσο και του αυξητικού χόνδρου, αλλά και σε οστεοβλάστες, οστεοκλάστες και κύτταρα του μυελού των οστών. Σε κάθε υπό μελέτη ομάδα, η έκφραση του IGF-1 ήταν παράλληλη μεταξύ των διαμερισμάτων του χόνδρου και αντιστρόφως ανάλογη με την ηλικία κύησης στην ομάδα των υγιών ατόμων και της ε.κ.α. Κατά τη σύγκριση των ομάδων, οι μέση τιμή συνολικά ως προς την έκφραση του IGF-1 εμφάνιζε στατιστικά σημαντική διαφορά με εντονότερη έκφραση στα υγιή έμβρυα και ακολουθούσαν κατά σειρά η ομάδα της ε.κ.α. και οι σκελετικές δυσπλασίες. Επίσης, στη σύγκριση των ομάδων ανά τρίμηνο κυήσεως, αναδείχθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στο 1ο και 2ο τρίμηνο στην αυξητική ζώνη, περιαγγειακά και συνολικά στο χόνδρο με ανάλογο τρόπο όπως προαναφέρθηκε. Σε ό,τι αφορά τις υποομάδες των σκελετικών δυσπλασιών, βρέθηκε ότι η έκφραση του IGF-1 ήταν υψηλότερη στην ατελή οστεογένεση υποπεριοστικά και περιαγγειακά σε σχέση με τις άλλες σκελετικές δυσπλασίες. Δεν ταυτοποιήθηκε σημαντική συσχέτιση στην έκφραση του IGF-1 με το φύλο, τη θανατηφόρο ή μη έκφραση κάθε δυσπλασίας και την ιστολογική οργάνωση του χόνδρου.Στην παρούσα μελέτη, ο IGF-1 ανιχνεύθηκε ανοσοϊστοχημικά σε όλα τα διαμερίσματα του αρθρικού χόνδρου, καθώς και στα χονδροκύτταρα της υποπεριχονδριακής περιοχής, αλλά και σε κύτταρα της μετάφυσης του μηριαίου οστού, όπως οστεοβλάστες, οστεοκύτταρα, οστεοκλάστες και κύτταρα του μυελού των οστών. Η παρατήρηση αυτή δεν έχει περιγραφεί στο παρελθόν σε ανθρώπινο έμβρυο, ωστόσο τα βιβλιογραφικά δεδομένα σε πειραματικά μοντέλα είναι αντικρουόμενα ως προς την εντόπιση του IGF-1. Σε σχέση με τα φυσιολογικά έμβρυα, για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία καταγράφουμε ότι όσο η ηλικία κύησης αυξάνεται, αναλογικά πέφτουν τα επίπεδα έκφρασης του IGF-1 συνολικά στο χόνδρο. Το εύρημα αυτό συμφωνεί με βιβλιογραφικά δεδομένα που καταγράφουν τη συνολική έκφραση του IGF-1 στο οστό. Στην ομάδα της ενδομήτριας καθυστέρησης της αύξησης παρατηρήθηκε ανάλογη ανάστροφη συσχέτιση με την ηλικία κύησης, αν και λιγότερο ισχυρή. Στην ομάδα των σκελετικών δυσπλασιών, παρατηρήθηκε πτωτική τάση στην έκφραση του IGF-1, χωρίς όμως στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την ηλικία κύησης. Αυτό πιθανώς εξηγείται από το γεγονός ότι ήδη τα έμβρυα του 1ου τριμήνου έχουν μειωμένη έκφραση του IGF-1 σε σχέση με τα αντίστοιχα φυσιολογικά. Το εύρημα ότι η έκφραση του IGF-1 συνολικά στο χόνδρο είναι υψηλότερη στην ομάδα των υγιών εμβρύων σε σχέση με την ομάδα των σκελετικών δυσπλασιών, αλλά και σε σχέση με την ομάδα της ενδομήτριας καθυστέρησης της αύξησης είναι αναμενόμενη και επιβεβαιώνει το ρόλο του αυξητικού παράγοντα στην κατά μήκος αύξηση των μακρών οστών. Επίσης, η στατιστικά πολύ έντονη διαφορά στην αυξητική ζώνη αυτή μεταξύ υγιών – σκελετικών δυσπλασιών, μεταξύ υγιών – ε.κ.α., αλλά και μεταξύ σκελετικών δυσπλασιών – ε.κ.α., τη στιγμή που σε άλλα διαμερίσματα δεν ήταν τόσο έντονη, αντικατοπτρίζει την ιδιαίτερη σημασία της δράσης του IGF-1 στη ζώνη αυτή. Αναφορικά με την έκφραση του IGF-1 στις τρεις ομάδες σε σχέση με τα τρίμηνα της κυήσεως, το σημαντικό εύρημα ήταν ότι ενώ δεν τεκμηριώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στον εν ηρεμία χόνδρο, βρέθηκε πολύ έντονη συσχέτιση στην αυξητική ζώνη. Δηλαδή υπήρχε στατιστικά πολύ έντονη διαφορά στη ζώνη αυτή μεταξύ υγιών – σκελετικών δυσπλασιών, μεταξύ υγιών – ε.κ.α., αλλά και μεταξύ σκελετικών δυσπλασιών – ε.κ.α. στο 1ο και 2ο τρίμηνο της κύησης, όπου διαπιστώνονται και οι ταχύτεροι ρυθμοί ανάπτυξης του εμβρύου. Στο 3ο τρίμηνο οι διαφορές εξαλείφθηκαν. Θα πρέπει εδώ να σημειωθεί ότι στην ομάδα των σκελετικών δυσπλασιών σημαντική εκπροσώπηση ως προς τον αριθμό των περιστατικών εμφανίζει η θανατηφόρος δυσπλασία τύπου Ι, η οποία με βάση τη βιβλιογραφία, εντάσσεται στην κατηγορία των μεταλλάξεων του FGFR-3, ο οποίος έχει ως κύρια περιοχή έκφρασης την αυξητική ζώνη και συνεπώς αυτό συμφωνεί με τα δεδομένα της παρούσας μελέτης. Τέλος, η διαφορά στην έκφραση του IGF-1 υποπεριχονδριακά και περιαγγειακά στην ομάδα της ατελούς οστεογένεσης σε σχέση με τις υπόλοιπες ομάδες (υψηλότερη έκφραση στην ατελή οστεογένεση), πιθανώς εξηγείται από το γεγονός ότι η ατελής οστεογένεση είναι πάθηση που αφορά σε ελαττωμένη οστική πυκνότητα λόγω μεταλλάξεων στο γονίδιο του κολλαγόνου 1α1. Δηλαδή, το οστό αυξάνει κατά μήκος, αλλά υφίσταται κατάγματα και παραμορφώσεις που οδηγούν σε βράχυνση του μέλους.Συμπερασματικά, στα υγιή έμβρυα και σε μικρότερο βαθμό στα πάσχοντα από σκελετικές δυσπλασίες ή από ενδομήτρια καθυστέρηση της ανάπτυξης, η τοπική έκφραση του IGF-1 στο χόνδρο του μηριαίου οστού βαίνει ελαττούμενη σε σχέση με την ηλικία. Επίσης, έκφραση του IGF-1 είναι σημαντικά αυξημένη στα υγιή έμβρυα σε σχέση με τα έμβρυα που εμφανίζουν βραχύτητα των οστών είτε λόγω γενετικά καθοριζόμενης σκελετικής δυσπλασίας είτε λόγω ενδομήτριας καθυστέρησης της ανάπτυξης. Αυτό σημαίνει ότι ο IGF-1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη φυσιολογική κατά μήκος αύξηση. Η πιο έκδηλη διαφορά στην έκφραση του IGF-1 μεταξύ υγιών εμβρύων και πασχόντων από σκελετικές δυσπλασίες ή από ενδομήτρια καθυστέρηση της αύξησης ήταν στην αυξητική ζώνη, γεγονός που συμβαδίζει με την κομβική λειτουργία της αυξητικής ζώνης στην κατά μήκος αύξηση.