Γενετική μελέτη της μαστίτιδας στα γαλακτοπαραγωγά πρόβατα

Abstract

The overall objectives of this study was to investigate the relationship between mastitis and milk production, to estimate genetic parameters of mastitis related traits and validate the effects of previously discovered SNP on these traits in of Greek Chios dairy sheep population. The study was carried out in four commercial farms of purebred Chios dairy ewes. A total of 609 ewes in 1st or 2nd lactation were used. Milk samples from individual ewes were collected in monthly intervals for the first five months of lactation. Each sample was subjected to cytological examination using California mastitis test (CMT). Tests were also performed in the laboratory to assess somatic cell count (SCC) and total viable bacterial count (TVC). Ewes having milk with SCC≥ 500,000/ml and CMT score ≥2 were subjected to bacteriological examination. All animals were genotyped with a customized 960 SNP DNA. All data analyses were performed using SPSS 20©. The results showed that 638/2436 samples (26.1%) were considered positive for subclinical mastitis, but the microbiological tests confirmed only 349 samples (72.55%). Coagulase negative staphylococci (66.2%), Staphylococcus aureus (22.6%) and Streptococcus spp. (7.7%) were the prevalent bacteria. Mastitis had an adverse effect on daily milk yield. The negative effect of mastitis on milk production was justified (about 66ml/ewe/day). The second stage of our research was about genetic parameters and genomic markers associated with mastitis resistance. Each trait (MY, SCC, CM, CMT and TVC) was analyzed separately with a univariate random regression model. The ASREML software was used for statistical analyses. Individual monthly records were adjusted for the fixed effects of flock, year-season of lambing, lactation number, age at lambing and week of lactation. Residuals and de-regressed estimates of the animal effects were used as phenotypes in genome wide association studies (GWAS). The software GEMMA was used to run the GWAS analyses based on a mixed model that included the genomic relationship matrix among individuals as a random effect. Individual SNP found significant in GWAS at genome-wide level were further tested with a mixed model to verify their significance. Weekly heritability estimates for SCC, TVC and CMT, were always greater than zero (P≤0.05). Repeatability estimates for SCC, CM, TVC and CMT were all statistically significant (P≤0.05). In the case of CM, distinguishing the animal genetic from the permanent environment effect was not possible. These results reveal a substantial amount of heritable and repeatable variation in the first four weeks of lactation, suggesting that early lactation records are amenable for genetic evaluation and management practices aiming at improving disease resistance. Results of GWAS revealed 22 SNP markers located on chromosomes 2, 5, 16 and 19 with a genome-wide significant association with at least one of the mastitis related traits. A total of 18 of these SNP were subsequently verified with the mixed model analysis; six, three, two and seven SNP were located on chromosomes 2, 5, 16 and 19, respectively. None of these SNP had an effect on milk production implying that no adverse effects of a mastitis resistance program should be anticipated.

Η παρούσα ερευνητική εργασία είχε ως στόχο τη διερεύνηση του προβλήματος της μαστίτιδας στις γαλακτοπαραγωγές προβατίνες, κυρίως σε γενετικό επίπεδο, ώστε να εξαχθούν χρήσιμα συμπεράσματα για την πρακτική προσέγγισή του στις εκτροφές αλλά, και την μακροπρόθεσμη αντιμετώπισή του μέσω της γενετικής βελτίωσης. Η έρευνα πραγματοποιήθηκε σε δύο φάσεις: Η πρώτη φάση αφορούσε τη διερεύνηση της σχέσης της μαστίτιδας με τη γαλακτοπαραγωγή. Για την έρευνά μας χρησιμοποιήθηκαν 609 καθαρόαιμες προβατίνες πρώτης και δεύτερης γαλακτικής περιόδου από 4 εκτροφές. Ατομικά δείγματα γάλατος συλλέγονταν μηνιαία κατά τους τέσσερις πρώτους μήνες της γαλακτικής περιόδου. Σε κάθε δείγμα γινόταν δοκιμή Καλιφόρνιας (CMT) και τα αποτελέσματα αξιολογούνταν με πενταβάθμια κλίμακα, καθώς και προσδιορισμός των σωματικών κυττάρων (ΑΣΚ) στο εργαστήριο. Στη συνέχεια, γινόταν μικροβιολογικές εξετάσεις σε δείγματα γάλατος με ΑΣΚ ≥500.000 κύτταρα/ml και βαθμολογία CMT ≥2. Με τη χρήση μη παραμετρικών μεθόδων πραγματοποιήθηκε στατιστικός έλεγχος διαφοράς του Α.Σ.Κ μεταξύ των κατηγοριών του CMT. Η συσχέτιση μεταξύ του Α.Σ.Κ στο γάλα και του CMT διενεργήθηκε με τη χρήση του συντελεστή συσχέτισης Spearman (r). Τα 638/2436 δείγματα (26,1%) πληρούσαν τις παραπάνω προϋποθέσεις για να χαρακτηριστούν ενδεικτικά υποκλινικής μαστίτιδας και στο 72,55% αυτών το αποτέλεσμα των μικροβιολογικών εξετάσεων ήταν θετικό (349 δείγματα). Οι παθογόνοι μικροοργανισμοί που απομονώθηκαν ήταν οι Coagulase negative staphylococci (66,2%), ο Staphylococcus aureus (22,6%) και ο Streptococcus spp. (7,7%). Ο βαθμός συσχέτισης μεταξύ των δύο μεθόδων ήταν υψηλός (r=0,747). Επιπλέον, υπολογίστηκε η επίδραση παραμέτρων που σχετίζονται με τη μαστίτιδα στη γαλακτοπαραγωγή. Τα αποτελέσματα έδειξαν, ότι η παρουσία κλινικής μαστίτιδας προκάλεσε μείωση της γαλακτοπαραγωγής κατά 66,4 ml. Ωστόσο, η επίδραση αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (P>0,05). Αντίθετα, η επίδραση του ΑΣΚ, της δοκιμής Καλιφόρνιας και της ΟΜΧ ήταν σημαντική. Στη δεύτερη ενότητα περιγράφεται η διερεύνηση της σχέσης μεταξύ της μαστίτιδας με γενετικές παραμέτρους και επιλεγμένους γενετικούς δείκτες. Mε βάση τα δεδομένα από την πρώτη φάση της έρευνάς μας, πραγματοποιήθηκε εκτίμηση γενετικών παραμέτρων χαρακτηριστικών που σχετίζονται με τη μαστίτιδα. Η επεξεργασία έγινε με μικτά στατιστικά πρότυπα. Επιπλέον, στο σύνολο των ζώων που συμμετείχαν στην έρευνά μας έγινε, μία φορά, αιμοληψία με στόχο να χρησιμοποιηθούν τα δείγματα αίματος για εκχύλιση DNA. Ακολούθησε έλεγχος ποιότητας απομονωμένου DNA και γενοτύπηση με προσαρμοσμένη συστοιχία DNA (960 SNP’s). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μέσες τιμές του συντελεστή κληρονομησιμότητας (h2) για τον ΑΣΚ, την ΚΜ, την ΟΜΧ και το CMT ήταν 0,17±0,04, 0, 0,16±0,03 και 0,18±0,05, αντίστοιχα. Οι μέσες τιμές του συντελεστή επαναληπτικότητας (r) για τον ΑΣΚ, την ΚΜ, την ΟΜΧ και το CMT ήταν 0,62±0,04, 0,41±0,04, 0,33±0,03, 0,67±0,03, αντίστοιχα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της μελέτης GWAS εμφάνισαν 22 γενετικούς δείκτες που εντοπίστηκαν στα χρωμοσώματα 2, 5, 16 και 19. Συμπεραίνεται, ότι η εφαρμογή ενός προγράμματος γενετικής βελτίωσης, ως προς την ανθεκτικότητα στη μαστίτιδα, είναι ένας εφικτός στόχος στα πρόβατα της φυλής Χίου. Ιδιαίτερο εύρημα αποτελεί το γεγονός ότι κανένας από τους δείκτες που εντοπίστηκαν δεν επηρεάζει τη γαλακτοπαραγωγή του ζώου. Τέλος, στις εκτροφές προβάτων, που εφαρμόζονται ήδη προγράμματα γενετικής βελτίωσης για την αύξηση της γαλακτοπαραγωγής, θα μπορούσε παράλληλα να ξεκινήσει η διαδικασία επιλογής ανθεκτικών γενοτύπων ως προς την κλινική μαστίτιδα με τη χρήση έμμεσων παραμέτρων.