Chromatin organization at the nuclear periphery: subnuclear localization and expression of microRNA genes in cells of the murine adaptive immune system

Abstract

The last few years it has become increasingly clear that higher order chromatin organization controls the regulation of genome activity and serves as an additional epigenetic mechanism that modulates cellular functions and gene expression programs in diverse biological processes. Spatial positioning of different gene loci can be directly linked to gene expression while deregulation of the nuclear architecture can be linked to severe diseases. Control of gene expression is of vital importance for all organisms. Allelic interactions and gene repositioning with functional importance are common during the regulation of immune responses. Nowadays more and more studies support the correlation between chromatin organization and gene regulation. Except from the histone modifications and transcription factors non coding RNAs can also control gene expression. MicroRNAs constitute an abundant class of endogenous and highly conserved small non-coding RNAs molecules (ncRNAs) that play an important role in modulating gene expression at the transcriptional and post-transcriptional level. microRNAs have been implicated in quite diverse biological processes including stem cell self-renewal, differentiation, proliferation, apoptosis and the regulation of immune responses in both innate and adaptive immune system. Although there is cumulative information regarding the steady state mature microRNA levels and their respective targets, little is known about the effect of the three-dimensional chromatin architecture on the transcriptional regulation of microRNA gene loci. In this study we sought to investigate the impact of nuclear architecture as an epigenetic mechanism regulating the expression and the subnuclear localization of eight microRNA genes upon transcriptional activation in CD4+ T cells during development and differentiation, in discrete T cell lineages. More specifically, we investigated the role of subnuclear localization of microRNA gene loci as a potential mechanism affecting non-coding genome expression. Apart from highlighting the impact of the nuclear periphery in microRNA gene expression, this study introduces other factors that may modulate the subnuclear positioning or the expression.Our results show that eight microRNA gene loci (miR-181a1b1, miR-181a2b2, miR-181c, miR-142, miR-146a, miR-17-92, miR-155 and miR-let7e) are mainly monoallelically expressed and localized in the cell nuclear periphery irrespective of the gene’s transcriptional status or the cell’s differentiation state. Moreover, our results show that the microRNA Microprocessor complex [comprised by DROSHA and DiGeorge syndrome critical region gene 8 (DGCR8) proteins also localizes in the nuclear periphery of T cells, indicating a functional role in the transcriptional regulation of microRNA genes. We also found that microRNA gene loci were significantly enriched, compared to coding genes, for nuclear pore proteins (NUP) (such as NUP153 and NUP93) implying that nuclear pore proteins may be implicated in tethering microRNA gene loci to the nuclear periphery. The genome organizer protein SATB1 can affect the expression and the localization of microRNA genes in thymocytes but also in CD4+ cells, showing its important role as the main chromatin organizer in T cells. Fianlly, the expression profile and perinuclear localization of microRNA genes are developmentally conserved while their localization outside constitutive lamin associated domains (cLAD) is cross-species conserved in H. sapiens, M. musculus, D. melanogaster and C. elegans. In conclusion all the above data unveil a link between the 3D architecture of chromatin in T cells and its impact on the subnuclear localization and expression of microRNA gene loci. Our results pinpoint the impact of nuclear periphery in microRNA gene expression, shed light on chromatin organization at the nuclear periphery and allow for a better understanding of the T cell genome organization.

Τα τελευταία χρόνια καθίσταται ολοένα και πιο σαφές ότι η χρωματινική οργάνωση σχετίζεται άμεσα με το γονιδίωμα και χρησιμεύει ως ένας επιπρόσθετος επιγενετικός μηχανισμός που ρυθμίζει τις κυτταρικές λειτουργίες και την γονιδιακή έκφραση σε ποικίλες βιολογικές διεργασίες. Η υποπυρηνική τοποθέτηση διαφορετικών γενετικών τόπων μπορεί να συνδεθεί άμεσα με την έκφραση γονιδίων, ενώ η απορύθμιση της υποπυρηνικής αρχιτεκτονικής μπορεί να συνδεθεί με σοβαρές ασθένειες. Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης είναι ζωτικής σημασίας για όλους τους οργανισμούς. Οι αλληλικές αλληλεπιδράσεις καθώς και η υποπηρηνική μετακίνηση γενετικών τόπων με λειτουργική σημασία είναι κοινές κατά τη διάρκεια της ρύθμισης των ανοσολογικών αποκρίσεων. Σήμερα, όλο και περισσότερες μελέτες υποστηρίζουν τη συσχέτιση μεταξύ της οργάνωσης της χρωματίνης και της ρύθμισης των γονιδίων. Εκτός από τις τροποποιήσεις ιστονών και τους παράγοντες μεταγραφής, τα microRNAs μπορούν επίσης να ελέγξουν τη γονιδιακή έκφραση. Τα microRNA αποτελούν μια κατηγορία ενδογενών και εξαιρετικά διατηρημένων μικρών μορίων RNAs που παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε μεταγραφικό και μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Τα microRNAs έχουν εμπλακεί σε βιολογικές διεργασίες, όπως στην αυτοανανέωση των βλαστοκυττάρων, την διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και την ρύθμιση των ανοσολογικών αποκρίσεων τόσο στο έμφυτο όσο και στο επίκτητο ανοσοποιητικό σύστημα. Αν και σήμερα υπάρχει πληθώρα πληροφοριών σχετικά με τα ώριμα microRNAs και τους αντίστοιχους στόχους τους, λίγα είναι γνωστά για την επίδραση της τρισδιάστατης χρωματινικής δομής στη μεταγραφική ρύθμιση των microRNA γενετικών τόπων. Στη παρούσα μελέτη επιδιώξαμε να διερευνήσουμε τον ρόλο της πυρηνικής αρχιτεκτονικής ως επιγενετικού μηχανισμού που ρυθμίζει την έκφραση και τον υποπυρηνικό εντοπισμό οκτώ microRNA γενετικών τόπων κατά την μεταγραφική ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των CD4+ κυττάρων. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι οκτώ microRNA γενετικοί τόποι (miR-181a1b1, miR-181a2b2, miR-181c, miR-142, miR-146a, miR-17-92, miR-155 και miR-let7e) εντοπίζονται στην κυτταρική πυρηνική περιφέρεια ανεξαρτήτως της μεταγραφικής κατάστασης του γονιδίου ή της κατάστασης διαφοροποίησης του κυττάρου. Επιπλέον, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το πρωτεΐνικο σύμπλεγμα του Microprocessor [που αποτελείται από τις πρωτεΐνες DROSHA και DGCR8) εντοπίζεται επίσης στην πυρηνική περιφέρεια των Τ κυττάρων, υποδεικνύοντας ένα λειτουργικό ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής των microRNA γονιδίων. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι οι microRNA γενετικοί τόποι εμπλουτίστηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τα γονίδια που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες των πυρηνικών πόρων (NUP) (όπως NUP153 και NUP93) υποδηλώνοντας πως αυτές οι πρωτεΐνες ενδέχεται να είναι υπεύθυνες για την περιφεριακή τοποθέτηση των microRNA γενετικών τόπων. Η πρωτεΐνη SATB1 (γνωστή ως οργανωτής του γονιδιώματος) μπορεί επισης να επηρεάσει την έκφραση και τον εντοπισμό των microRNA γονιδίων στα θυμοκύτταρα αλλά και στα CD4+ κύτταρα, τονίζοντας την σημασία αυτής της πρωτεΐνης στην χρωματινική οργάνωση των Τ κυτταρων. Τέλος, τόσο η έκφραση όσο και η περιφεριακή τοποθέτηση των microRNA γονιδίων βρέθηκαν να είναι συντηρημένες κατά την κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση, ενώ ο εντοπισμός τους εκτός (cLAD) περιοχών είναι συντηρημένος μεταξύ διαφορετικών ειδών όπως Η. Sapiens, Μ. Musculus, D. melanogaster και C. elegans. Συμπερασματικά, όλα τα παραπάνω δεδομένα αποκαλύπτουν μια σύνδεση μεταξύ της τρισδιάστατης αρχιτεκτονικής της χρωματίνης στα Τ κύτταρα αλλά και της επίδρασής της στον υποπυρηνικό εντοπισμό και την έκφραση microRNA γονιδίων. Τα αποτελέσματά μας, αποκαλύπτουν την επίδραση της πυρηνικής περιφέρειας στην έκφραση των microRNA γονιδιών, παρέχουν περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την οργάνωση της χρωματίνης στην πυρηνική περιφέρεια και επιτρέπουν την καλύτερη κατανόηση της οργάνωσης του πολύπλοκου γονιδιώματος των Τ κυττάρων.