Διαφορική ρύθμιση των γονιδίων του μείζονος συμπλόκου ιστοσυμβατότητας τάξης ΙΙ από τη μεθυλοτρανσφεράση PRMT6, μέσω μιας AT-hook, μιας νέας πρωτεϊνικής επικράτειας του RFX5

Abstract

The MHCII family of genes is of central importance to the development and function of the adaptive immune system. Transcription of all members of the family is controlled by the Class II Transactivator, CIITA, and a set of DNA-binding factors, among which RFX5, the main subunit of the RFX trimer, is the most important. Previous work in our lab had shown that RFX5 is subject to arginine methylation by the PRMT family of methyltransferaces. The aim of this work was to map the arginine residues-targets of methylation and to investigate the biological significance of these methylations.The initial phase of this work consisted of methylation mapping, and was done in two stages: First, the regions that contained the arginines-targets of methylation were determined, by subsequent rounds of cloning, expressing and methylating gradually smaller regions of RFX5. The exact arginine residues-targets were then determined by single aminoacid mutagenesis of all the candidate arginine residues. This mapping revealed that methylation targets are located in specific regions of RFX5. Their importance was assessed during the second phase of the project, using both experimental and bioinformatic approaches, the latter revealing the existence of an AT-hook, an auxiliary DNA-binding domain, on RFX5. The existence and function of this domain were previously unknown. On the contrary, AT-hooks are known targets of arginine methylation by PRMT6. The last part of this work focused in investigating the newly identified AT-hook’s contribution to MHCII transcription, and the role of PRMT6, if any, in its’ regulation. To this end, we created and analysed stable cell lines using either the wild type RFX5, or a version bearing an AT-hook deletion (RFX5-Δhook). PRMT6 effect was then studied using in vivo overexpression experiments.Our results show that the AT-hook function varies depending on the MHCII isotype examined. PRMT6 effect, which is mediated by the AT-hook, also differs depending on the isotype examined. PRMT6 effect thus constitutes the first discovered mechanism by which differential regulation of the MHCII genes can be achieved under normal conditions, a discovery that apart from its’ mechanistic interest has also immunological implications and potential clinical applications.

Η οικογένεια των γονιδίων του Μείζονος Συμπλόκου Ιστοσυμβατότητας τάξης ΙΙ (MHCII) είναι καθοριστικής σημασίας για την ανάπτυξη και λειτουργία του επίκτητου ανοσοποιητικού συστήματος. Η μεταγραφή όλων των μελών της οικογένειας ελέγχεται από τον κύριο ενεργοποιητή τους, CIITA, και ένα σύνολο παραγόντων προσδενόμενων στο DNA, από τους οποίους σημαντικότερος είναι ο RFX5. Προηγούμενα αποτελέσματα από το εργαστήριό μας έδειξαν ότι ο RFX5 υπόκειται σε μεθυλίωση αργινίνης από την οικογένεια μεθυλοτρανσφερασών PRMT. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η χαρτογράφηση και διερεύνηση της βιολογικής σημασίας των μεθυλιώσεων αυτών.Η χαρτογράφηση των αργινινών-στόχων μεθυλίωσης αποτέλεσε το πρώτο μέρος της εργασίας και έγινε σε δύο φάσεις: Αρχικά προσδιορίστηκαν οι περιοχές που περιείχαν τα κατάλοιπα αργινίνης-στόχους μεθυλίωσης, μέσα από μια διαδικασία διαδοχικών κλωνοποιήσεων, έκφρασης των αντίστοιχων πρωτεϊνών και μεθυλιώσεων in vitro, ενώ στη συνέχεια έγινε πιο λεπτομερής χαρτογράφηση με την κατασκευή μοναδιαίων μεταλλαγών όλων των αργινινών των περιοχών αυτών. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας αξιολογήθηκε η σημασία των μεθυλιώσεων αυτών, τόσο πειραματικά όσο και με μεθόδους βιοπληροφορικής. Κατά την ανάλυση αυτή εντοπίστηκε μία βοηθητική επικράτεια πρόσδεσης του DNA, τύπου AT-hook. Η ύπαρξη της επικράτειας αυτής στο μόριο του RFX5 ήταν προηγουμένως άγνωστη, ενώ αντίθετα, η μεθυλίωση αργινίνης τέτοιων επικρατειών, και συγκεκριμένα από τη μεθυλοτρανσφεράση PRMT6, έχει δημοσιευτεί στο παρελθόν. Το τρίτο μέρος της εργασίας αυτής εστιάστηκε στη διερεύνηση του ρόλου της επικράτειας AT-hook και της πιθανής ρύθμισής της από την PRMT6. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν και μελετήθηκαν σταθεροί κλώνοι που φέρουν είτε τον αγρίου τύπου, είτε μία μορφή του παράγοντα RFX5 με έλλειψη της AT-hook (RFX5-Δhook), ενώ ο ρόλος της PRMT6 διερευνήθηκε με πειράματα υπερέκφρασής της in vivo. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η AT-hook παρουσιάζει διαφορετική δράση ανάλογα με την ισομορφή MHCII που εξετάζεται. Το ίδιο παρατηρείται και για την επίδραση της PRMT6, η δράση της οποίας διαμεσολαβείται από την AT-hook. Η επίδραση της PRMT6 αποτελεί επομένως τον πρώτο γνωστό μηχανισμό με τον οποίο μπορεί να γίνει διαφορική ρύθμιση της έκφρασης των MHCII υπό φυσιολογικές συνθήκες, μία ανακάλυψη με ιδιαίτερο μηχανιστικό και ανοσολογικό ενδιαφέρον, αλλά και πιθανές κλινικές εφαρμογές.