Μελέτη των μορίων RPA και NFkB σε διάχυτα αστροκυτώματα εγκεφάλου

Abstract

Replication protein A (RPA), is a single stranded DNA (ssDNA)-binding protein which is required for stabilization of ss-DNA and identified in replication foci where members of cyclin-dependent kinases (CDKs) –cyclin complexes are also present. It is a protein of heterotrimer composed of three tightly associated subunits of 70, 32 and 14kDa, referred as RPA1, RPA2 and RPA3 respectively.NF-κB proteins comprise a family of structurally- related transcription factors, including NF-κB1 (p50), p65 (RelA), c-Rel, p52 and RelB, all of which have a conserved N-terminal Rel homology domain (RHD) that contains the DNA-binding and dimerization regions. NF-κB is present in the cytosol in an inactive state, complexed with the inhibitory IkB protein. Following several signaling events, free NF-κB accumulates in the nucleous, where it is able to transactivate several target genes implicated in cell survival/apoptosis, cell growth, immune response, and inflammation. Although NF-κB has been reported to be constitutively activated in various neoplasms, little information is available about its clinical significance in astrocytomas.In this study we investigated the association of NF-κB1/p50 and pIkBa immunohistochemical expression with clinicopathologic features in paraffin- embedded tissue from 82 patients with astrocytomas. We also investigated the expression of RPA1 and RPA2 subunits of RPA protein in correlation with cyclin D2, cyclin D3 and NF-κB expression and assessed their prognostic significance in 61 patients with astrocytomas.pIkBa expression was positively correlated with nuclear (p=0,0010) and negatively with cytoplasmic (p=0,0008) NF-κB1/p50 expression. Nuclear NF-κB1/p50 and pIkBa expression increased with tumor grade (p=0,0001 and p<0,0001 respectively). Nuclear NF-κB1/p50 expression was positively correlated with RPA1, RPA2, Cyclin D2 and D3 expression, although these relationships failed to retain their statistical significance when they were adjusted for histologic grade.Statistically significant positive associations emerged also between: RPA1 and RPA2 protein expression (p<0,0001). Cyclin D2 and D3 expression (p<0,0001). RPA1, RPA2, cyclins D2 and D3 expression and histologic grade (p=0,0001 in all correlations). RPA1 and cyclin D2 or D3 expression (p<0,0001). RPA2 and cyclin D2 or D3 expression (p<0,0001).Myltivariated analysis selected NF-κB/p50 expression as an independent prognostic factor not only for the entire cohort (p= 0,0220), but also for grades II/III (p=0,0029) and grade IV cases (p=0,0310).RPA2 expression appeared to independently affect survival in grade IV (p=0,005) as well as in the entire cohort (p=0,006). RPA1 , cyclin D2 and cyclin D3 appeared not to influence survival in lower grades (II/III), either by univariate of by multivariate analysis.Our results suggest that nuclear NF-κB1/p50 expression is dictated by its interaction with IkBa in astrocytomas and is associated with tumor grade, denoting the importance of nuclear NF-κB/p50 expression in patient’s prognosis.On the other hand RPA1, RPA2, cyclin D2 and cyclin D3, seem to have a parallel role in the promotion of cell cycle in astrocytic tumors, being implicated in the malignant progression of these neoplasms. Moreover, RPA2 protein appears also to be another useful prognostic indicator in patients with astrocytomas.

Η πρωτεΐνη αντιγραφής Α (RPA) είναι μια πρωτεΐνη σύνδεσης της μονής έλικας DNA η οποία απαιτείται για την σταθεροποίησή της και ανευρίσκεται στις θέσης αντιγραφής όπου ανευρίσκονται, επίσης, μέλη των συμπλεγμάτων κυκλινών- εξαρτομένων από τις κυκλίνες κινασών. Είναι μια ετεροτριμερής πρωτεΐνη που αποτελείται από τρεις ισχυρά συνδεδεμένες υπομονάδες των 70, 32 και 14kDa που καλούνται RPA1, RPA2 και RPA3 αντίστοιχα.Οι πρωτεΐνες NF-κB αποτελούν μία οικογένεια δομικά σχετιζόμενων μεταγραφικών παραγόντων, που συμπεριλαμβάνει τις: NF-κB1 (p50), p65 (RelA), c-Rel, p52 και RelB. Οι πρωτεΐνες αυτές έχουν διατηρήσει την αμινοτελική Rel ομόλογη περιοχή που συμπεριλαμβάνει περιοχές σύνδεσης του DNA και διμερισμού. Ο NF-κB βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα σε ανενεργή μορφή συνδεδεσμένος με την πρωτεΐνη αναστολέα IkB. Ως αποτέλεσμα σηματοδότης, ελεύθερα μόρια NF-κB συσσωρεύονται στον πυρήνα, όπου μπορούν να ενεργοποιήσουν γονίδια στόχους που εμπλέκονται στην κυτταρική επιβίωση/απόπτωση, κυτταρική αύξηση, ανοσοαπόκριση και φλεγμονή. Παρότι έχει αναφερθεί η συστηματική ενεργοποίηση του παράγοντα NF-κB σε διαφορετικούς τύπους νεοπλασμάτων, λίγα είναι γνωστά για την κλινική σημασία του σε αστροκυτώματα.Στην παρούσα μελέτη μελετήθηκε η συσχέτιση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης του NF-κB1/p50 και του pIkBa με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους σε υλικό από κύβους παραφίνης, προερχόμενο από 82 ασθενείς με αστροκυτώματα. Μελετήθηκε, επίσης, η έκφραση των υπομονάδων RPA1 και RPA2 της πρωτεΐνης RPA σε σχέση με τις κυκλίνες D2, D3 και τον NF-κB και διερευνήθηκε η προγνωστική σημασία τους σε 61 ασθενείς με αστροκυτώματα Η έκφραση του pIkBa συσχετιζόταν θετικά με την πυρηνική (p=0,0010) και αρνητικά με την κυτταροπλασματική (p=0,0008) έκφραση του NF-κB1/p50. Tόσο η πυρηνική έκφραση του NF-κB1/p50, όσο και η έκφραση του pIkBa αυξάνονταν παράλληλα με το βαθμό κακοηθείας (grade) (p=0,0001, p<0,0001 αντίστοιχα). Η πυρηνική έκφραση του NF-κB1/p50 συσχετιζόταν θετικά με την έκφραση των RPA1, RPA2, κυκλίνης D2 κυκλίνης D3, αν και οι συσχετίσεις αυτές απέτυχαν να διατηρήσουν τη στατιστική σημαντικότητά τους όταν διορθώθηκαν ως προς τον ιστολογικό βαθμό κακοηθείας (grade).Θετικές στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις προέκυψαν επίσης μεταξύ: RPA1 και RPA2 (p<0,0001). Κυκλίνης D2 και D3 (p<0,0001). Κάθε ενός των παραγόντων RPA1, RPA2, κυκλίνης D2 και D3 και του ιστολογικού βαθμού κακοηθείας (grade) (p=0,0001 σε όλες τις συσχετίσεις). RPA1 και κυκλίνης D2 ή D3 (p<0,0001). RPA2 και κυκλίνης D2 ή D3 (p<0,0001).Η πολυπαραγοντική ανάλυση επέλεξε την έκφραση του NF-κB/p50 ως ανεξάρτητου προγνωστικού δείκτη όχι μόνο για το συνολικό δείγμα (p= 0,0220), αλλά επίσης και για τις υποομάδες των grades II/III (p=0,0029) και grade IV περιπτώσεων (p=0,0310).Η έκφραση της RPA2 φαίνεται να επηρεάζει ανεξάρτητα την επιβίωση στην υποομάδα των grade IV ασθενών (p=0,005), όπως επίσης και στο συνολικό δείγμα (p=0,006). Οι παράγοντες RPA1, κυκλίνη D2 και κυκλίνη D3 φαίνεται να μην επηρρεάζουν την επιβίωση στην ομάδα των χαμηλότερων grades (II/III), τόσο σε μονοπαραγοντική όσο και σε πολυπαραγοντική ανάλυση. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η πυρηνική έκφραση του NF-κB1/p50 υπαγορεύεται από την αλληλεπίδρασή του με τον IkBa στα αστροκυτώματα και συσχετίζεται με το βαθμό κακοηθείας, κάνοντας φανερή τη σημασία της πυρηνικής έκφρασης του NF-κB/p50 ως προς την πρόγνωση του ασθενούς.Παράλληλα οι παράγοντες RPA1, RPA2, κυκλίνη D2 και κυκλίνη D3, φαίνεται να διαδραματίζουν παράλληλο ρόλο στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου σε αστροκυτταρικούς όγκους, εμπλέκόμενοι στην κακοήθη εξέλιξη των νεοπλασμάτων αυτών. Ιδιαιτέρως η πρωτεΐνη RPA2 φαίνετα να αποτελεί έναν νεό χρήσιμο προγνωστικό παράγοντα σε ασθενείς με αστροκύτωμα.