Ανάπτυξη και μελέτη λειτουργικών συμπολυμερών που φέρουν βιοστατικές ομάδες

Abstract

Microbial contamination remains one of the most serious risks of global public health, because it affects too many fields, such as medical devices, drugs, health care, water purification systems, sterilization of the soil, paints, dental and surgical equipment, food packaging, food storage, hulls of ships, textiles and nets. Various antimicrobial agents have been developed for the elimination of microbes, but they present several disadvantages, such as volatility, toxicity to the environment, limited duration of action and penetration into human or animal skin. To overcome these problems, the research community in recent years has focused on attractive alternative antimicrobial polymeric materials. Ιn this thesis, synthesis of novel environmentally friendly functional copolymers bearing groups with antimicrobial activity was attempted. For the synthesis of the copolymers, appropriate characteristic units were selected, and, depending on the functionality and the purpose of their use, they can be classified into six categories: hydrophilic units (acrylic acid-AA, sodium 4-styrene sulfonate-SSNa) , hydrophobic units (methyl methacrylate-MMA, tert-butyl acrylate-tBA, glycidyl methacrylate-GMA), covalent attachment units of the antimicrobial species (4-vinylbenzyl chloride -VBC), electrostatic binding units of the antimicrobial species (SSNa), units bearing reactive groups (AA, GMA) and probing units (2-pyridine 4-phenyl 7-styrylquinoline-QPy). The reagents used for the covalent attachment in VBC unit and the electrostatic interaction in SSNa unit were N,N-dimethylhexadecylamine (HAM) and hexadecyltrimethylammonium bromide (AmC16) or hexadecyltributylphosphonium bromide (PhC16) respectively.Initially, random copolymers via free radical polymerization (FRP) technique were prepared. At first, P(MMA-co-VBCx) and P(SSNa-co-VBCx) random copolymers at different MMA and SSNa compositions (mol/mol) were synthesized and characterized with proton nuclear magnetic resonance (1H NMR) and Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), while for the MMA-containing copolymers the molecular weight was determined by size exclusion chromatography (SEC). After polymerization, the VBC unit was modified with HAM, am amine bearing long hydrocarbon chain. For comparison, another amine having a small number of carbon atoms (triethylamine-TEAM) was also used. From the 1H NMR and FT-IR characterization was verified that random copolymers P(MMA-co-VBCx) were fully modified, leading to hydrophobic polycations P(MMA-co-VBCTEAMx) or hydrophilic/hydrophobic modified polycations P(MMA-co-VBCHAMx), while P (SSNa-co-VBC) copolymers were partially modified, leading to the synthesis of polyampholytes P(SSNa-co-VBCTEAM-co-VBCx) and hydrophobically modified polyampholytes P(SSNa-co-VBCHAM-co-VBCx). To overcome the problem of partial quaternization, the P(SSNa-co-VBCHAMx) random copolymers were synthesized through direct polymerization of SSNa unit and 4-vinylbenzyldimethylhexadecylammonium chloride (VBCHAM). Furthermore, the synthesis of P(AA-co-VBCHAMx) random copolymers with two different synthetic procedures and the subsequent characterization with 1H NMR and Fourier tranform infrared attenuated total reflectance (ATR-FTIR) was accomplished. From the turbidimetry and Nile red fluorescence probing technique was found that the solubility behavior and self-organization of these copolymers in water are mainly influenced by the net charge of the copolymer and not by the nature of the hydrophobic or charged unit. Also, the introduction of the cationic amphiphilic groups (VBCHAM) promotes the self-organization of the final hydrophobically modified polymers, due to formation of aggregates in aqueous solution. In a next step, P(GMA-co-VBCHAMx), P(GMA-co-SSAmC16x) and P(QPy-co-SSNax) random copolymers were prepared and characterized by 1H NMR and FT-IR, while P(SSAmC16-co-VBCHAMx) random copolymers synthesis was accomplished. These class of polymers combine the two types of antimicrobial incorporation into one system, operated through both contact-based and release-based mechanism. The antimicrobial activity of the synthesized polymer was investigated on cultures of Gram-negative (P. aeruginosa, E.coli) and Gram-positive (S. aureus, E. faecalis) bacteria within 3 to 24 hours of exposure at 4 and 22oC. It was found that the combination of hydrophilic monomer AA, at low contents, with the unit VBCHAM resulted in a strong biostatic activity against P. aeruginosa and E. Faecalis, and the combination of VBCHAM unit with the SSAmC16 unit led to effective antimicrobial materials, particularly against Gram-positive bacteria.Based on the experience and the antimicrobial and physicochemical properties of random copolymers, proper copolymers with controlled properties, and specifically block copolymers, were designed, taking into account the synthetic limitations and solubility problems, since they are particularly demanding structures. For this purpose, synthesis of diblock copolymers through atom transfer radical polymerization (ATRP) was attempted, using hydrophobic macro-initiators based on MMA and tBA for further polymerization of the cationic monomer 4-vinylbenzyl dimethylhexadecylammonium chloride (VBCHAM). Subsequent hydrolysis of the tBA units led to the formation of the hydrophilic AA blocks. Moreover, copolymers consisting of VBCHAM and SSAmC16 units were synthesized using as macro-initiators both PVBCHAM and PSSAmC16. All the polymers were characterized by 1H NMR and ATR-FTIR, while SEC was performed in some selected polymers. Also, the possibility of self-organization of the copolymers in ethanol and methanol was identified through transmission electron microscopy (TEM). The difficulty in the preparation of these diblock copolymers is evidenced by the existence of several failed attempts at the synthesis of the above copolymers, the moderate or low yield and the unsuccessful attempts for the synthesis of SSNa and VBCHAM diblock copolymers and the synthesis of homopolymers PSSNa, PVBCHAM and PSSAmC16 with photoinduced living radical polymerization. Such as random copolymers, the block copolymers with the stongest bacteriostatic action were those containing the VBCHAM unit with AA or SSAmC16 units.Due to synthetic problems in the preparation of block copolymers, the synthesis of polymers with controlled properties through a simple synthetic method was proposed, which included mild polymerization conditions and organic synthesis techniques. For this purpose, two classes of random copolymers were synthesized with FRP, the P(GMAx-co-SSAmC16) and P(AAy-co-VBCHAM) copolymers, with GMA and AA units bearing the reactive epoxide and carboxyl groups respectively. The reaction between these two series of copolymers, with x and y being the content in mol of the two active units, was investigated in mixtures and obtained through solution casting after treatment of the formed membranes at various temperatures. The combined results from the ATR-FTIR characterization of the membranes, solubility tests, turbidimetry and TEM suggest that the reaction takes place already at 80oC, leading mostly to graft samples, while insoluble crosslinked samples are usually obtained at higher curing temperatures (120oC or 150oC). Antimicrobial tests also revealed that the crosslinked membranes presented strong bacteriostatic action against S. aureus and P. aeruginosa. As a conclusion, this approach provides a facile and easily adaptable methodology for the preparation of functional antimicrobials for various applications.

Η μικροβιακή μόλυνση αποτελεί έναν από τους σοβαρότερους κινδύνους παγκοσμίως για τη δημόσια υγεία, διότι επηρεάζει πάρα πολλά πεδία, όπως είναι οι ιατρικές συσκευές, τα φάρμακα, η υγειονομική περίθαλψη, τα συστήματα καθαρισμού του νερού, η αποστείρωση του χώματος, τα χρώματα, ο οδοντιατρικός και χειρουργικός εξοπλισμός, οι συσκευασίες και η αποθήκευση των τροφίμων, τα ύφαλα των πλοίων, τα υφάσματα και τα δίχτυα. Για την καταπολέμηση των μικροβίων, έχουν αναπτυχθεί διάφοροι αντιμικροβιακοί παράγοντες, που όμως εμφανίζουν πολλά μειονεκτήματα, όπως η πτητικότητα, η τοξικότητα στο περιβάλλον, ο μικρός χρόνος δράσης και η διείσδυση στο ανθρώπινο ή ζωικό δέρμα. Για να ξεπεραστούν αυτά τα προβλήματα, η ερευνητική κοινότητα τα τελευταία χρόνια στρέφεται ολοένα και περισσότερο στην ελκυστική εναλλακτική λύση των αντιμικροβιακών πολυμερικών υλικών.Συνεπώς, στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιχειρήθηκε η σύνθεση νέων λειτουργικών συμπολυμερών, φιλικών προς το περιβάλλον, που φέρουν ομάδες με αντιμικροβιακή δράση. Για τη σύνθεση των συμπολυμερών έγινε επιλογή κατάλληλων χαρακτηριστικών δομικών μονάδων, οι οποίες, ανάλογα με την λειτουργικότητά τους και το σκοπό για τον οποίο χρησιμοποιήθηκαν, μπορούν να ταξινομηθούν σε έξι κατηγορίες: υδρόφιλες μονάδες (ακρυλικό οξύ-AA, 4-στυρενοσουλφονικό νάτριο-SSNa), υδρόφοβες μονάδες (μεθακρυλικός μεθακρυλεστέρας-MMA, τριτοταγής ακρυλικός βουτυλεστέρας-tBA, μεθακρυλικός γλυκιδυλεστέρας-GMA), μονάδες ομοιοπολικής σύνδεσης του αντιμικροβιακού είδους (χλωριούχο 4-βινυλοβενζύλιο-VBC), μονάδες ηλεκτροστατικής σύνδεσης του αντιμικροβιακού είδους (SSNa), μονάδες που φέρουν δραστικές ομάδες (AA, GMA) και μονάδες ιχνηθέτησης (2-πυρίδινο 4-φαίνυλο 7-στυρυλοκινολίνη-QPy). Οι ενώσεις που χρησιμοποιήθηκαν για την ομοιοπολική δέσμευση στη μονάδα VBC και την ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση στη μονάδα SSNa ήταν η Ν,Ν-διμεθυλοδεκαεξυλαμίνη (ΗΑΜ) και το βρωμιούχο δεκαεξυλοτριμεθυλαμμώνιο (AmC16) ή το βρωμιούχο δεκαεξυλοτριβουτυλοφωσφόνιο (PhC16) αντίστοιχα.Σε πρώτο στάδιο, παρασκευάστηκαν στατιστικά συμπολυμερή με την τεχνική του πολυμερισμού ελευθέρων ριζών (FRP). Αρχικά, συντέθηκαν τα στατιστικά συμπολυμερή P(MMA-co-VBCx) και P(SSNa-co-VBCx) σε διάφορα ποσοστά MMA και SSNa (mol/mol) και χαρακτηρίστηκαν με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού υδρογόνου (1H NMR) και φασματοσκοπία υπερύθρου μέσω μετασχηματισμού Fourier (FT-IR), ενώ για τα συμπολυμερή με MMA προσδιορίστηκε το μοριακό βάρος με χρωματογραφία αποκλεισμού μεγεθών (SEC). Μετά τον πολυμερισμό, η μονάδα VBC τροποποιήθηκε με την αμίνη HAM που φέρει μακριά υδρογονανθρακική αλυσίδα. Για λόγους σύγκρισης, χρησιμοποιήθηκε επίσης μια αμίνη με μικρό αριθμό ατόμων άνθρακα (τριαιθυλαμίνη-TEAM). Από τον χαρακτηρισμό με 1H NMR και FT-IR πιστοποιήθηκε ότι τα στατιστικά συμπολυμερή P(MMA-co-VBCx) έχουν τροποποιηθεί πλήρως, οδηγώντας στα υδρόφοβα πολυκατιόντα P(MMA-co-VBCTEAMx) ή στα υδρόφοβα/υδροφοβικά τροποποιημένα πολυκατιόντα P(MMA-co-VBCHAMx), ενώ τα συμπολυμερή P(SSNa-co-VBCx) τροποποιήθηκαν μερικώς, οδηγώντας στη σύνθεση των πολυαμφολυτών P(SSNa-co-VBCTEAM-co-VBCx) και των υδρόφοβα τροποποιημένων πολυαμφολυτών P(SSNa-co-VBCHAM-co-VBCx). Για να ξεπεραστεί το πρόβλημα της μερικούς τεταρτοταγοποίησης, συντέθηκαν τα συμπολυμερή P(SSNa-co-VBCHAMx) μέσω απευθείας πολυμερισμού της μονάδας SSNa και του χλωριούχου 4-βινυλοβενζυλοδιμεθυλοδεκαεξυλαμμωνίου (VBCHAM). Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε σύνθεση των στατιστικών συμπολυμερών P(AA-co-VBCHAMx) με δύο διαφορετικές συνθετικές πορείες και χαρακτηρίστηκαν με 1H NMR και φασματοσκοπία υπερύθρου εξασθενημένης ολικής ανάκλασης μέσω μετασχηματισμού Fourier (ATR-FTIR). Από τη μελέτη των αποτελεσμάτων των τεχνικών θολομετρίας και ιχνηθέτησης με Nile red βρέθηκε ότι η συμπεριφορά διαλυτότητας και αυτο-οργάνωσης αυτών των συμπολυμερών σε νερό επηρεάζονται κυρίως από το καθαρό φορτίο του συμπολυμερούς και όχι από τη φύση της υδρόφοβης ή φορτισμένης μονάδας, όπως επίσης και ότι η εισαγωγή του κατιονικών αμφίφιλων ομάδων (VBCHAM) ευνοεί την αυτο-οργάνωση των τελικών υδρόφοβα τροποποιημένων πολυμερών, σχηματίζοντας συσσωματώματα σε υδατικό διάλυμα. Στη συνέχεια, παρασκευάστηκαν τα στατιστικά συμπολυμερή P(GMA-co-VBCHAMx), P(GMA-co-SSAmC16x) και P(QPy-co-SSNax) και χαρακτηρίστηκαν με 1H NMR και FT-IR, ενώ παράλληλα πραγματοποιήθηκε η σύνθεση μιας νέας κατηγορίας στατιστικών συμπολυμερών, των συμπολυμερών P(SSAmC16-co- VBCHAMx), τα οποία συνδυάζουν τα δύο είδη ενσωμάτωσης του αντιμικροβιακού σε ένα σύστημα, καθώς λειτουργούν τόσο μέσω επαφής όσο και μέσω απελευθέρωσης. Η αντιμικροβιακή δραστικότητα των συντεθειμένων πολυμερών ερευνήθηκε σε καλλιέργειες αρνητικών κατά Gram (P. aeruginosa, E.coli) και θετικών κατά Gram (S. aureus, Ε faecalis) βακτηρίων μέσα σε 3 και 24 ώρες από την έκθεση στους 4 και 22oC. Διαπιστώθηκε ότι ο συνδυασμός του υδρόφιλου μονομερούς ΑΑ, σε χαμηλές συστάσεις, με τη μονάδα VBCHAM εμφάνισε υψηλή βιοστατική δραστικότητα έναντι της P. aeruginosa και του Ε. faecalis και ο συνδυασμός της μονάδας VBCHAM με τη μονάδα SSAmC16 οδήγησε σε αποτελεσματικά αντιμικροβιακά υλικά, ιδιαίτερα έναντι των θετικών κατά Gram βακτηρίων.Με βάση την εμπειρία και τις αντιμικροβιακές και φυσικοχημικές ιδιότητες των στατιστικών συμπολυμερών, προωθήθηκε ο σχεδιασμός συμπολυμερών ελεγχόμενης οργάνωσης, και πιο συγκεκριμένα, συμπολυμερών με συσταδική αρχιτεκτονική, λαμβάνοντας όμως υπόψιν και τους συνθετικούς περιορισμούς και τα προβλήματα διαλυτότητας, μιας που πρόκειται για ιδιαίτερα απαιτητικές δομές. Γι’ αυτό το σκοπό, επιχειρήθηκε η σύνθεση δισυσταδικών συμπολυμερών με πολυμερισμό ριζών μέσω μεταφοράς ατόμου (ATRP) χρησιμοποιώντας υδρόφοβους μακρο-εκκινητές με βάση τις μονάδες ΜΜΑ και tBA για περαιτέρω πολυμερισμό του κατιονικού μονομερούς χλωριούχο 4-βινυλοβένζυλο διμεθυλοδεκαεξυλαμμώνιο (VBCHAM). Μετέπειτα υδρόλυση των μονάδων tBA οδήγησε στο σχηματισμό των υδρόφιλων συστάδων AA. Επιπλέον, και σε αυτή την περίπτωση συντέθηκαν συμπολυμερή αποτελούμενα από τις μονάδες VBCHAM και SSAmC16, χρησιμοποιώντας ως μακροεκκινητές τόσο το PVBCHAM όσο και το PSSAmC16. Όλα τα πολυμερή χαρακτηρίστηκαν με 1H NMR και ATR-FTIR, ενώ πραγματοποιήθηκε SEC σε όποια πολυμερή ήταν εφικτό, και επιπλέον, πιστοποιήθηκε η δυνατότητα αυτo-οργάνωσης των συμπολυμερών σε αιθανόλη και μεθανόλη μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης (TEM). Η δυσκολία στην παρασκευή των συγκεκριμένων δισυσταδικών συμπολυμερών αποδεικνύεται από την ύπαρξη αρκετών αποτυχημένων προσπαθειών στη σύνθεση των παραπάνω συμπολυμερών, στη μέτρια έως χαμηλή απόδοση και στις ανεπιτυχείς προσπάθειες για τη σύνθεση των δισυσταδικών συμπολυμερών με SSNa και VBCHAM, καθώς επίσης και για τη σύνθεση των ομοπολυμερών PSSNa, PVBCHAM και PSSAmC16 με φωτοεπαγόμενο ζωντανό πολυμερισμό ριζών. Όπως και στην περίπτωση των στατιστικών συμπολυμερών, έτσι και στα συσταδικά, την ισχυρότερη βακτηριοστατική δράση εμφάνισαν τα συμπολυμερή της μονάδας VBCHAM με τις μονάδες AA και SSAmC16.Λόγω των δεδομένων συνθετικών δυσκολιών στην παρασκευή των συσταδικών συμπολυμερών, επιχειρήθηκε η σύνθεση πολυμερών ελεγχόμενης οργάνωσης μέσω μιας απλής συνθετικής μεθόδου, η οποία περιελάμβάνε ήπιες τεχνικές πολυμερισμού και αντιδράσεις οργανικής σύνθεσης. Για το σκοπό αυτό συντέθηκαν με FRP δύο σειρές στατιστικών συμπολυμερών, τα συμπολυμερή P(GMAx-co-SSAmC16) και P(AAy-co-VBCHAM) με τις μονάδες GMA και AA να φέρουν τις δραστικές ομάδες εποξειδίου και καρβοξυλίου αντίστοιχα. Η αντίδραση μεταξύ αυτών των δύο σειρών συμπολυμερών, με x και y να είναι η περιεκτικότητα σε mol των δύο δραστικών μονάδων, διερευνήθηκε σε μείγματα που ελήφθησαν μέσω χύτευσης του διαλύματος και ύστερα από κατεργασία των σχηματιζόμενων μεμβρανών σε διάφορες θερμοκρασίες. Τα συνδυασμένα αποτελέσματα από το χαρακτηρισμό των σχηματιζόμενων μεμβρανών με ATR-FTIR, από τις δοκιμές διαλυτότητας, τη θολομετρία και το ΤΕΜ υποδεικνύουν ότι η αντίδραση λαμβάνει χώρα ήδη από τους 80oC, οδηγώντας ως επί το πλείστον σε εμβολιασμένα πολυμερή, ενώ αδιάλυτα διασυνδεδεμένα δείγματα λαμβάνονται συνήθως σε υψηλότερες θερμοκρασίες (120οC ή 150oC). Οι αντιμικροβιακές δοκιμές αποκάλυψαν ότι οι διασυνδεδεμένες μεμβράνες παρουσίασαν ισχυρή βακτηριοστατική δράση κατά των S. aureus και P. Aeruginosa, καθιστώντας την παρούσα προσέγγιση ως εύκολα προσαρμόσιμη μεθοδολογία για την παρασκευή λειτουργικών αντιμικροβιακών για διάφορες εφαρμογές.