Ανοσοϊστοχημική μελέτη βιολογικών παραγόντων σε καλοήθη νεοπλάσματα των σιαλογόνων αδένων

Abstract

Introduction:Interaction between cancer and normal tissue cells as well as extracellular matrix (stroma) leads to the failing of homeostatic mechanisms of tissues and the subsequent growth of tumors through processes like neoangiogenesis, epithelial – mesenchymal transition, migration of cancer cells through connective tissue and infiltration of normal tissue, apoptosis, metastasis (lymphogenous or haematogenous) and regulation of cancer stem cells. Cancer cells, from malignant or benign tumors, through genetic mutation survive and proliferate without restriction with minimal adhesion to the extracellular matrix, succeed to avoid signals of apoptosis or growth inhibition and involve neoangiogenesis in order to acquire the necessary nutrients for their survival. Benign tumors are restricted to expand and displace adjacent tissue. These interactions are dictated by structural and biochemical properties of the extracellular matrix and communication between tumor cells and normal tissue cells through the mediation of certain macromolecules.Aim: The aim of this study was to examine the expression of BMP-2, MMP-2, MMP-9, TGF-β1 and Osteopontin in benign tumors of the salivary glands, and specifically in pleomorphic adenomas and Warthin’s cystadenolymphomas.Material and methods: The material consisted of 97 specimens of benign parotid tumors (46 Warthin cystadenolymphomas and 51 pleomorphic adenomas) collected from patients 21 to 80 years old between 2000 and 2010 at G.H.A. ‘‘Ippokrateion’’ and the ENT clinic. From each fixated paraffin block 4μm slices were obtained, using a microtome and the avidin-biotin-peroxidase immunohistochemical procedure was used to detect the expression of each macromolecule.The antibodies included:Baf355BMP2,4 , R&D – monoclonal goat antibody diluted to 1:150 using thyroid nodular carcinoma specimens as controls to detect BMP-2.Ε-3284, Spring Bioscience – multiclonal rabbit antibody diluted to 1:100 using breast adenocarcinoma specimens as controls to detect osteopontin.-5289, Santa Cruz Biotechnology Inc – multiclonal mouse antibody diluted to 1:50 using thyroid nodular carcinoma specimens as controls to detect TGFβ1. Springe 18014 – multiclonal rabbit antibody diluted to 1:100 using oral acanthocytic carcinoma specimens as controls to detect MMP-2.Ingenex 80404 – multiclonal rabbit antibody diluted to 1:100 using oral acanthocytic carcinoma specimens as controls to detect MMP-9.The expression of each molecule was determined on each glass slide using a semi-quantitative scale from 0 to 3. The results were assessed as follows: 0 for specimens with up to 5% lightly stained cells in each visual microscopic field, 1 for specimens with < 75% lightly stained cells or 5 – 30% heavily stained cells per visual microscopic field, 2 for specimens with > 75% lightly stained cells or 30 – 75 heavily stained cells per visual microscopic field and 3 for specimens with > 75% heavily stained cells per visual microscopic field, for each of the molecules examined immuhistochemically.Fisher’s exact test was used to assess the correlation between each molecule expression and the tumor type. Ordinal logistic regression was applied to determine the the correlation between tumor type and molecule expression adjusting for age and sex and to obtain odds ratios and confidence intervals (two-way, 5% threshold).Results: MMP-2 and MMP-9 expression was detected in the cytoplasm of both tumor types. As for MMP-9, only a mediocre level of expression was observed in both pleomorphic adenomas and Warthin’s tumors without any statistically significant difference between the two. On the other hand, a significant difference in the level of expression of MMP-2 was observed, with an odds ratio of above 15 that the level of expression of MMP-2 in Warthin’s tumors was higher than in pleomorphic adenomas. We conclude that there exists a significant correlation between MMP-2 expression and tumor type. This difference in MMP-2 expression between salivary glands benign tumor types has not been reported in other studies. Furthermore, Warthin’s tumors showed no expression of either osteopontin or TGF-β1, whereas pleomorphic adenomas displayed a limited expression of both these macromolecules, albeit in less than 20% and 13% of specimens respectively.We also observed a high level of expression of BMP-2 both pleomorphic adenomas and Warthin’s tumors, but there was also a significant difference, since the expression in Warthin’s tumors was markedly increased. This information covers a gap in bibliography, since no other study had compared BMP-2 expression between pleomorphic adenomas and Warthin’s tumors, even though a relatively high expression of BMP-2 had been reported as opposed to no expression in other salivary gland tumors such as cystadenocarcinoma, adenocarcinoma, muoepithelial carcinoma, basal cell carcinoma. Conclusions: 1) The significantly elevated expression of BMP2 in Warthin’s tumors compared to pleomorphic adenomas provides a new insight into its role in the pathogenesis of this type of benign salivary gland tumor.2) The elevated expression of MMP2 in Warthin’s tumors compared to pleomorphic adenomas, suggests that this macromolecule may be involved in the development and may play a role in the biologic behavior of this group of tumors.3) The low expression of both osteopontin and TGFβ1 in a small percentage of pleomorphic adenomas underlines that these molecules do not participate in the pathogenesis of those benign neoplasms. Further studies are needed in order to further investigate and elucidate the involvement of these biologic factors in the development and behavior pattern of benign salivary gland tumors.

Εισαγωγή:Η αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων με τα κυτταρικά και μη (εξωκυττάρια θεμέλια ουσία) στοιχεία του μικροπεριβάλλοντός τους (στρώμα – tumor stroma) οδηγεί τελικά σε αποτυχία των ομοιοστατικών μηχανισμών του ιστού και ανάπτυξη του όγκου διαμορφώνοντας παράγοντες της καρκινογένεσης όπως επιθηλιακή – μεσεγχυματική μετάπτωση (epithelial-mesenchymal transition, EMT), μετανάστευση καρκινικών κυττάρων διαμέσου συνδετικού ιστού και διείσδυση σε φυσιολογικούς ιστούς, μετάσταση, νεοαγγειογένεση, απόπτωση και ρύθμιση της λειτουργίας των προγονικών καρκινικών κυττάρων.Έτσι, τα καρκινικά κύτταρα, καλοήθων ή κακοήθων όγκων, αποκτούν μέσω γενετικής μετάλλαξης τη δυνατότητα να επιζούν και να πολλαπλασιάζονται χωρίς περιορισμούς με ελάχιστη προσκόλληση στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, να αποφεύγουν και σήματα ανάσχεσης του πολλαπλασιασμού ή σήματα απόπτωσης και να εξασφαλίζουν τα αναγκαία θρεπτικά συστατικά με νεοαγγειογένεση. Οι καλοήθεις όγκοι περιορίζονται σε επέκταση, μηχανική παρεκτόπιση και διάβρωση των γειτονικών ιστών. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές καθορίζονται από δομικές και βιοχημικές ιδιότητες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας καθώς και από την επικοινωνία των κυττάρων του όγκου με μη νεοπλασματικά κύτταρα των ιστών. Σκοπός: Ο σκοπός της μελέτης μας είναι η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση της έκφρασης των μακρομορίων BMP-2, MMP-2, MMP9, TGFβ1και οστεοποντίνη σε καλοήθεις όγκους σιαλογόνων αδένων, και ειδικότερα σε πλειόμορφα αδενώματα και κυσταδενολεμφώματα (όγκους Warthin).Υλικό-Μέθοδος: Το υλικό της έρευνας αφορούσε συνολικά 97 όγκους παρωτίδος που εξαιρέθηκαν σε διάστημα 10 ετών από 2000 – 2010 στο Γ.Ν.Α. «Ιπποκράτειο” από την Ωτορινολαρυγγολογική κλινική, από ασθενείς ηλικίας 21 έως 80 ετών, 46 εκ των οποίων αναγνωρίστηκαν ως όγκοι Warthin και 51 ως πλειόμορφα αδενώματα. Από το αρχείο ανευρέθηκαν οι αντίστοιχοι κύβοι παραφίνης. Από κάθε μονιμοποιημένο και εγκλεισμένο σε κύβο παραφίνης δείγμα έγινε λήψη τομών πάχους 4μm με τη βοήθεια υπερμικροτόμου και έγινε ανοσοϊστοχημική μελέτη με την ενζυμική μέθοδο συμπλέγματος αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (ABC) για να εξετάσουμε την έκφραση των μακρομορίων που μας ενδιέφεραν.Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα εξής:Για ανίχνευση της BMP – 2 :(baf355BMP2,4 , R&D) – μονοκλωνικό αντίσωμα αίγας σε αραίωση 1:150 με θετικούς μάρτυρες δείγματα θηλωδών καρκινωμάτων θυρεοειδούςΓια την ανίχνευση της Οστεοποντίνης: (Ε-3284, Spring Bioscience) – πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού σε αραίωση 1:100 με θετικούς μάρτυρες ιστολογικές τομές από αδενοκαρκινώματα μαστού.Για την ανίχνευση του TGFβ1: (SC-5289, Santa Cruz Biotechnology Inc) – πολυκλωνικό αντίσωμα ποντικού σε αραίωση 1:50 με θετικούς μάρτυρες ιστολογικές τομές από θηλώδη καρκινώματα θυρεοειδούς.Για την ανίχνευση του MMP-2: (Springe 18014) – πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού σε αραίωση 1:100 με θετικούς μάρτυρες ιστολογικές τομές από ακανθοκυτταρικό καρκίνο στόματοςΓια την ανίχνευση του MMP-9: (Ingenex 80404) – πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού σε αραίωση 1:100 θετικούς μάρτυρες ιστολογικές τομές από ακανθοκυτταρικό καρκίνο στόματος.Η έκφραση των μακρομορίων αξιολογήθηκε σε κάθε πλακίδιο με μια ημιποσοτική κλίμακα βαθμολογίας 0-3. Η κλίμακα καθορίστηκε ως εξής: 0 στα δείγματα που εμφάνιζαν ασθενή χρώση σε <5% των κυττάρων κατά οπτικό πεδίο, 1 εάν εμφάνιζαν ασθενή χρώση σε < 75% των κυττάρων κατά οπτικό πεδίο (κ.ο.π.) ή έντονη χρώση σε 5 έως 30% των κυττάρων, 2 αν 30-75% των κυττάρων κ.ο.π. εμφάνιζαν έντονη χρώση ή >75% των κυττάρων ασθενή χρώση και 3 αν >75% των κυττάρων κ.ο.π. εμφάνιζαν έντονη χρώση (στην ανοσοϊστοχημική χρώση με το ειδικό για την κάθε ουσία αντίσωμα.Για τη διερεύνηση συσχέτισης μεταξύ του βαθμού έκφρασης του κάθε μακρομορίου και του είδους του όγκου χρησιμοποιήθηκε ο έλεγχος Fisher’s exact. Σε δεύτερο στάδιο, για να συνεκτιμηθεί τυχόν επίδραση της ηλικίας και του φύλου στην παραπάνω συσχέτιση, χρησιμοποιήθηκαν μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης για διατάξιμα δεδομένα (ordinal logistic regression) και εκτιμήθηκε ο σχετικός λόγος συμπληρωματικών πιθανοτήτων (odds ratio, OR) καθώς και το σχετικό 95% διάστημα εμπιστοσύνης (95% CI). Οι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν σε επίπεδο σημαντικότητας α=5% και ήταν αμφίπλευροι.Αποτελέσματα: Στη έρευνά μας ανιχνεύθηκαν MMP-2 και MMP-9 στο κυτταρόπλασμα και στα δύο νεοπλάσματα που εξετάσαμε και συγκεκριμένα παρατηρήθηκε κυτταροπλασματική έκφραση του MMP9 τόσο στα πλειόμορφα αδενώματα όσο και στους όγκους Warthin, χωρίς μάλιστα να διαπιστωθεί σημαντική διαφορά στο βαθμό έκφρασης, με την παρατηρούμενη πάντως έκφραση να είναι μέτρια και για τους δύο τύπους όγκων. Παρατηρήθηκε όμως εξαιρετικά σημαντική διαφορά στο βαθμό κυτταροπλασματικής έκφρασης της MMP2 ανάμεσα σε πλειόμορφα αδενώματα και όγκους Warthin, καθώς ο βαθμός έκφρασης ήταν 15 φορές πιθανότερο να είναι μεγαλύτερος σε όγκους Warthin σε σχέση με πλειόμορφα αδενώματα και επομένως διαπιστώνεται μια ισχυρή συσχέτιση της έκφρασης του MMP2 με τον τύπο του καλοήθους όγκους των σιελογόνων αδένων. Είναι η πρώτη φορά που διαπιστώνεται σημαντική διαφορά στην έκφραση του MMP2 ανάμεσα σε αυτούς τους δύο τύπους καλοήθων όγκων.Στη μελέτη μας παρατηρήθηκε μηδενική πρακτικά έκφραση της οστεοποντίνης σε όγκους Warthin και χαμηλή γενικά αλλά και περιορισμένη σε περίπου 20% του δείγματος στα πλειόμορφα αδενώματα.Παρατηρήθηκε επίσης μηδενική πρακτικά έκφραση του TGFβ1 σε όγκους Warthin και χαμηλή αλλά και περιορισμένη στο περίπου 13% των πλειόμορφων αδενωμάτων του δείγματος. Παρατηρήθηκε υψηλή έκφραση της ΒΜΡ-2 σε αμφότερους τους όγκους με στατιστικά σημαντικά υψηλότερη έκφραση στους όγκους Warthin. Αυτό το εύρημα καλύπτει το βιβλιογραφικό και ερευνητικό κενό. Έχει παρατηρηθεί υψηλή έκφραση BMP-2 σε πλειόμορφα αδενώματα αλλά όχι και σε άλλους όγκους σιαλογόνων αδένων, αν και έχει μελετηθεί σε κακοήθεις όγκους όπως κυσταδενοκαρκίνωμα αδενοκαρκίνωμα, μυοεπιθηλιακά καρκινώματα, βασικοκυτταρικά καρκινώματα. Συμπεράσματα: 1. Η σημαντικά υψηλότερη έκφραση BMP-2 σε όγκους Wathin σε σύγκριση με πλειόμορφα αδενώματα, αποτελεί ένα καινούργιο στόχο μελλοντικών ερευνών για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου αυτής της πρωτεϊνης στην παθογένεια του συγκεκριμένου καλοήθους όγκου των σιαλογόνων αδένων. 2. Η υψηλότερη έκφραση MMP-2 σε όγκους Warthin σε σχέση με πλειόμορφα αδενώματα υποδηλώνει ότι η MMP-2 πιθανότατα παίζει ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων αυτών και επηρεάζει τη βιολογική τους συμπεριφορά. 3. Το χαμηλό επίπεδο έκφρασης τόσο της οστεοποντίνης όσο και του TGFβ1 σε μικρό ποσοστό δειγμάτων πλειόμορφων αδενωμάτων υποδηλώνει ότι τα δύο αυτά μακρομόρια δεν φαίνεται να συμμετέχουν στην παθογένεια των καλοήθων αυτών όγκων των σιαλογόνων αδένων. Εν κατακλείδι, κρίνεται απαραίτητη η περαιτέρω διερεύνηση της έκφρασης αλλά και του μηχανισμού δράσης των βιολογικών αυτών μακρομορίων, ιδίως της BMP-2, αλλά και της MMP-2, ούτως ώστε να αποσαφηνιστεί ο ρόλος που διαδραματίζουν στην ανάπτυξη, την εξέλιξη και καθορισμό της βιολογικής συμπεριφοράς των όγκων των σιαλογόνων αδένων, καλοήθων και κακοήθων, με στόχο διαγνωστικές, προγνωστικές και θεραπευτικές εφαρμογές.