Molecular analysis of HURP protein’s role in oncogenesis

Abstract

The mitotic spindle is a highly dynamic microtubule-based apparatus that carries out the equalpartitioning of the duplicated chromosomes into two daughter cells during cell division.Spindle formation in mammalian somatic cells depends on coordinated activities of two biochemicalpathways the centrosome-dependent and chromatin-dependent spindle assembly pathways that satisfytwo widely accepted working models for spindle assembly, the centrosome search-and-capture and theself-organization model, respectively. It is currently understood that chromatin generates intracellularspatial organization signals that favor microtubule nucleation and/or stabilization activities. The mainchromosome-generated intracellular gradient that contributes to spindle self-organization is theRanGTP gradient. The GTP loaded small GTPase Ran exists in a declining concentration gradientaround the chromosome surface due to the chromatin association of its guanine exchange factorRCC1. Consequently, the chromatin generated RanGTP promotes spindle assembly by releasing NLS(Nuclear Localization Signal) containing SAFs (Spindle Assembly Factors) from inhibitory complexeswith importin α and/or β. The regulatory network of spindle assembly is additionally controlled by theaction of mitotic kinases, which lead to reversible phosphorylation events modulating thus the functionof MAPs (Microtubule Associated Proteins) and kinesins.The proper formation and function of the mitotic spindle is required for an error-free cell division.Nevertheless, even minor deregulation of these mitotic proteins, that does not compromise cell viability,can lead to abnormal cell division and eventually to aneuploidy, a hallmark of cancer. Over the pastyears, genetic and epigenetics alterations in a significant number of mitotic genes have been reportedin human tumors. The cancer-associated alterations in mitotic genes appear to affect mainly the geneexpression levels. The majority of the mitotic genes that are altered in cancer involve mainly kinases,spindle checkpoint proteins and structural proteins of the spindle including MAPs and kinesins.To this end we were directed towards the study of a key microtubule associated protein in spindleformation, the HURP protein (Hepatoma Up-Regulated Protein) as well as its potential role in cancer.HURP has been originally identified as a part of a RanGTP dependent multi-protein complex thatpromotes bipolar spindle assembly in Xenopus egg extracts and comprises of two additional MAPsTPX2 and XMAP215, the kinesin Eg5 and the kinase Aurora A. HURP is tightly regulated duringmitosis in terms of protein expression and localization. The protein levels of HURP peak at the G2/Mphase of the cell cycle and its localization is restricted to a subset of the spindle microtubules, thekinetochore microtubules (k-MTs). In metaphase spindles HURP localizes predominantly on the k-MTsin a gradient along pole-to-pole axis with higher concentrations at chromatin-proximal regions thatdecline toward the poles. HURP is an Aurora substrate itself and the phosphorylation of HURP hasbeen shown to stimulate oncogenic transformation of cultured cells. In order to better understand the role of HURP is spindle assembly we developed small moleculeinhibitors for the Aurora A kinase. In this study, from a panel of 105 potential small-molecule inhibitors,two compounds named Tripolin A and Tripolin B, inhibit Aurora A kinase activity in vitro. In humancancer cells however, only Tripolin A acts as an Aurora A inhibitor. We combined in vitro biochemicalassays and in vivo single cell confocal microscopy studies to examine the biological action of TripolinA. Our findings demonstrate that Tripolin A is an Aurora A non-ATP competitive inhibitor. Tripolin Areduces the localization of Aurora A on spindle MTs, affects centrosome integrity, spindle formationand length, as well as MT dynamics in interphase, consistent with Aurora A depletion. Interestingly,Tripolin A affects the gradient distribution towards the chromosomes, but not the MT-binding of HURP.FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) assays indicate that Aurora A regulates theturnover of HURP on spindle MTs. Therefore, we conclude that Aurora A phosphorylation maintains thegradient localization of HURP on the spindle MTs.Previous gene expression studies have identified over-expression of HURP in types of human cancerlike liver and urinary bladder cancer. To this end, we examined the gene expression levels of HURP ina series of cell lines that represent the multistep chemical carcinogenesis of the mouse skin in order torecapitulate the multistep process of cancer development in a cell line based model. The cell linesrepresent the development of the three distinct stages in carcinogenesis, tumor initiation, promotionand progression and are derived from two-stage induced mouse skin tumors, with DMBA/TPA (apolycyclic aromatic hydrocarbon/a phorbol ester). Thus, we performed gene expression analysis usingQuantitative Real Time PCR (qPCR) and Western blot and found that Hurp mRNA and protein levelsare elevated in the squamous carcinoma and anaplastic spindle carcinoma cell lines compared to thebenign papilloma cell lines. Collectively, we suggest that the levels of HURP expression in cancer donot correlate with benign hyperplasia but with malignant transformation.Taken together, the results of this study revealed a novel mode of regulation of HURP by the Aurora Akinase on the mitotic spindle. In addition we have given insights into the role of HURP in cancerprogression.

Η µιτωτική άτρακτος είναι µία µοριακή µηχανή δοµικά βασισµένη σε µικροσωληνίσκους, που παρουσιάζει ιδιαίτερη δυναµικότητα και διενεργεί την ίση κατανοµή των διπλασιασµένων χρωµοσωµάτων στα δύο θυγατρικά κύτταρα κατά την κυτταρική διαίρεση.Ο σχηµατισµός της ατράκτου σε σωµατικά κύτταρα θηλαστικών βασίζεται στις συντονισµένες δραστηριότητες δύο βιοχηµικών µονοπατιών: το µονοπάτι εξαρτώµενο από τα κεντροσώµατα και το µονοπάτι εξαρτώµενο από τη χρωµατίνη, τα οποία ικανοποιούν δύο ευρέως αποδεκτά µοντέλα για τη συναρµολόγηση της ατράκτου, το µοντέλο “search–and-capture” και το µοντέλο του “self-organization”,αντίστοιχα. Γνωρίζουµε ότι η χρωµατίνη παράγει ενδοκυτταρικά σήµατα χωρικής οργάνωσης που ευνοούν την εµπυρήνωση ή/και τη σταθεροποίηση των µικροσωληνίσκων. H κύρια ενδοκυττάρια διαβάθµιση συγκέντρωσης που δηµιουργείται από τα χρωµοσώµατα και συµβάλλει στην αυτο-οργάνωση της µιτωτικής ατράκτου είναι η διαβάθµιση συγκέντρωσης του RanGTP. Η µικρή GTPάσηRan όταν είναι συνδεδεµένη µε GTP, παρουσιάζει µια ενδογενή φθίνουσα διαβάθµιση συγκέντρωσης γύρω από την επιφάνεια των χρωµοσωµάτων λόγω παρουσίας εκεί του παράγοντα ανταλλαγής GTP,RCC1. Το RanGTP που επάγεται από τη χρωµατίνη προωθεί τη συναρµολόγηση της ατράκτου µέσω απελευθέρωσης παραγόντων που ευνοούν την συναρµολόγηση της ατράκτου (Spindle AssemblyFactors, SAFs) και περιέχουν σήµα πυρηνικού εντοπισµού (Nuclear Localization Signal, NLS) από ανασταλτικά σύµπλοκα µε ιµπορτίνες α ή / και β. Το ρυθµιστικό δίκτυο της συναρµολόγησης της ατράκτου ελέγχεται επιπροσθέτως από τη δράση των µιτωτικών κινασών που οδηγούν σε γεγονότα αναστρέψιµης φωσφορυλίωσης, ρυθµίζοντας έτσι τη λειτουργία των πρωτεϊνών που προσδένονται σε µικροσωληνίσκους (Microtubule Associated Proteins, MAPs) και των κινεσινών.Η σωστή διαµόρφωση και λειτουργία της µιτωτικής ατράκτου απαιτούνται για τη διενέργεια της κυτταρική διαίρεση χωρίς σφάλµατα. Παρ 'όλα αυτά, ακόµη και µια µικρή απορρύθµιση αυτών των µιτωτικών πρωτεϊνών, που δεν θέτει σε κίνδυνο τη βιωσιµότητα των κυττάρων, µπορεί να οδηγήσει σε ανώµαλη κυτταρική διαίρεση και τελικά σε ανευπλοειδία, ένα χαρακτηριστικό γνώρισµα του καρκίνου.Κατά τα τελευταία χρόνια, έχουν αναφερθεί γενετικές και επιγενετικές αλλοιώσεις σε έναν σηµαντικόαριθµό µιτωτικών γονιδίων σε ανθρώπινους όγκους. Οι αλλοιώσεις αυτές που παρουσιάζονται σε µιτωτικά γονίδια και σχετίζονται µε τον καρκίνο φαίνεται να επηρεάζουν κυρίως τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης. Η πλειοψηφία των µιτωτικών γονιδίων που παρουσιάζουν αλλοιώσεις στον καρκίνο περιλαµβάνει κυρίως κινάσες, πρωτεΐνες του σηµείου ελέγχου της ατράκτου και δοµικές πρωτεΐνες της ατράκτου συµπεριλαµβανοµένων των πρωτεϊνών που προσδένονται σε µικροσωληνίσκους και των κινεσινών.Για το σκοπό αυτό κατευθυνθήκαµε προς την µελέτη µίας πρωτεΐνης που προσδένεται σε µικροσωληνίσκους µε ρόλο-κλειδί στον σχηµατισµό ατράκτου, την πρωτεΐνη HURP (Hepatoma UpRegulated Protein) καθώς και προς τη µελέτη του πιθανού της ρόλου στον καρκίνο. Η HURP έχειαρχικά αναγνωριστεί ως µέρος ενός RanGTP εξαρτώµενoυ πολυ-πρωτεϊνικού σύµπλοκου που προάγει την συγκρότηση της διπολικής ατράκτου σε εκχυλίσµατα αυγών του βατράχου Xenopus και αποτελείται από δύο επιπλέον πρωτεΐνες που προσδένονται σε µικροσωληνίσκους την TPX2 και τηνXMAP215, την κινεσίνη Eg5 και την κινάση Aurora Α. Η HURP ρυθµίζεται αυστηρά κατά τη διάρκειατης µίτωσης ως προς τα επίπεδα έκφρασής της και ως προς τον εντοπισµό της. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης HURP φτάνουν στο µέγιστο κατά τη φάση G2/M του κυτταρικού κύκλου ενώ ο εντοπισµός της πρωτεΐνης περιορίζεται σε ένα υποσύνολο των µικροσωληνίσκων της ατράκτου, τους µικροσωληνίσκους του κινητοχώρου (k-ΜΤs). Στη µεταφασική άτρακτο η HURP εντοπίζεται κυρίως στους µικροσωληνίσκους του κινητοχώρου σε διαβάθµιση συγκέντρωσης κατά µήκος του άξονα των δύο πόλων παρουσιάζοντας υψηλότερη συγκέντρωση σε περιοχές κοντά στην χρωµατίνη, φθίνονταςπρος τους πόλους. Η HURP αποτελεί υπόστρωµα της Aurora Α και η φωσφορυλίωσή της διεγείρει τον ογκογόνο µετασχηµατισµό καλλιεργηµένων κυττάρων.Για να κατανοήσουµε καλύτερα το ρόλο της HURP στη συναρµολόγηση της ατράκτου αναπτύξαµε µικρά-µόρια αναστολείς της κινάσης Aurora Α. Σε αυτή τη µελέτη, από ένα σύνολο 105 πιθανών µικροµοριακών αναστολέων, δύο ενώσεις ο Tripolin Α και ο Tripolin Β, βρέθηκαν να αναστέλλουν την δραστικότητα της Aurora A κινάσης in vitro. Ωστόσο, σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, µόνο ο TripolinΑ δρα ως αναστολέας της Aurora Α. Συνδυάσαµε βιοχηµικά πειράµατα in vitro και µελέτες συνεστιακής µικροσκοπίας µεµονοµένων κυττάρων in vivo, για να εξετάσουµε τη βιολογική δραστικότητα τουTripolin Α. Τα ευρήµατά µας αποδεικνύουν ότι ο Tripolin Α είναι ένας αναστολέας της Aurora Α, µη-ανταγωνιστικός του ΑΤΡ. Ο Tripolin Α µειώνει τον εντοπισµό της Aurora Α στους µικροσωληνίσκουςτης ατράκτου, επηρεάζει την ακεραιότητα των κεντροσωµάτων, επηρεάζει τον σχηµατισµό και το µήκος της ατράκτου, καθώς και τη δυναµική των µικροσωληνίσκων στην µεσόφαση, αποτελέσµατα που συνάδουν µε απαλοιφή της Aurora A. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι ο Tripolin Α επηρεάζει την διαβάθµιση συγκέντρωσης της HURP προς τα χρωµοσώµατα, αλλά όχι την πρόσδεσή της στους µικροσωληνίκους. Πειράµατα ανάκτησης φθορισµού µετά από αποχρωµατισµό FRAP (FluorescenceRecovery After Photobleaching, FRAP) δείχνουν ότι η Aurora A ρυθµίζει την ανταλλαγή της HURP στις θέσεις πρόσδεσής της στους µικροσωληνίκους της ατράκτου. Ως εκ τούτου, καταλήγουµε στο συµπέρασµα ότι η φωσφορυλίωση από την Aurora A διατηρεί την διαβάθµιση συγκέντρωσης του εντοπισµού της HURP στην άτρακτο.Προγενέστερες µελέτες γονιδιακής έκφρασης έχουν εντοπίσει υπερέκφραση της HURP σε ανθρώπινους καρκίνους όπως τον καρκίνο του ήπατος και της ουροδόχου κύστης. Για το σκοπό αυτό εξετάσαµε τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης της HURP σε µια οµάδα κυτταρικών σειρών που αντιπροσωπεύουν την πολυσταδιακή χηµική καρκινογένεση της επιδερµίδας του ποντικού,προκειµένου να αναπαραστήσουµε την διαδικασία πολλαπλών βηµάτων για την ανάπτυξη του καρκίνου, σε ένα µοντέλο κυτταρικών σειρών. Οι κυτταρικές σειρές αντιπροσωπεύουν την ανάπτυξη των τριών διαφορετικών στάδιων της καρκινογένεσης, την έναρξης, την προώθηση και την εξέλιξης του όγκου και προέρχονται από όγκους του δέρµατος ποντικού που επάγονται σε δύο στάδια, µε επίδρασηDMBA / ΤΡΑ (πολυκυκλικός αρωµατικός υδρογονάνθρακας / φορβολικός εστέρας). Εφαρµόσαµε λοιπόν, ανάλυση γονιδιακής έκφρασης χρησιµοποιώντας ποσοτική PCR πραγµατικού χρόνου(Quantitative Real Time PCR, qPCR) και αποτύπωµα κατά Western καi βρήκαµε ότι τα επίπεδα mRNAκαι πρωτεΐνης του γονιδίου της Hurp είναι αυξηµένα στις κυτταρικές σειρές που προέρχονται απόκαρκινώµατα πλακώδων κυττάρων και από αναπλαστικά ατρακτοειδή καρκίνωµατα σε σύγκριση µε τις κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καλοήθη θηλώµατα. Συλλογικά, προτείνουµε ότι τα επίπεδα έκφρασης της HURP στον καρκίνο δεν συσχετίζονται µε την καλοήθη υπερπλασία αλλά αυξάνουν µε την κακοήθη εξαλλαγή.Στο σύνολό τους τα αποτελέσµατα αυτής της µελέτης αποκάλυψαν µια νέα ρυθµιστική λειτουργία της κινάσης Aurora A στην πρωτεΐνη HURP πάνω στη µιτωτική άτρακτο. Επιπλέον έχουµε δώσει νέες κατευθύνσεις σχετικά µε το ρόλο της HURP στην εξέλιξη του καρκίνου.